Перекисное окисление липидов (ПОЛ) представляет собой жизненно необходимое звено метаболического обмена. Основная функция его заключается в обновлении липидов клеточных мембран.
У здорового человека процессы перекисного окисления липидов контролируются так называемой антиокислительной системой, которая регулирует скорость и активность фосфорилирования путем связывания провоцирующих факторов или нейтрализации достаточного количества перекисей, чтобы не допустить переизбыток конечных продуктов обмена. Усиление процесса окисления может стать отправной точкой в патофизиологических процессах значительного количества заболеваний. Этот процесс включает в себя стадии ферментативного и неферментативного аутоокисления.
Для модификации фосфолипидного бислоя клеточных мембран проходит ферментативное окисление. Кроме того, он участвует в образовании биологически активных веществ, метаболических реакциях. Неферментативное же окисление проявляет себя как разрушающий фактор в жизни клетки. Из-за образования большого количества свободных радикалов и накопления перекисей активность антиоксидантной системы снижается и, как следствие, наблюдается гибель клеток организма.
Для начала перекисного окисления липидов необходимо наличие свободных радикалов кислорода, имеющих на крайнем энергетическом уровне один неспаренный электрон. После восстановления молекулы образуется супероксид кислорода, который реагирует с атомами водорода, превращаясь в перекись водорода. Для регулирования количества супероксидов внутри клетки существуют супероксиддисмутаза, образующая перекись водорода, а каталаза, пероксидаза нейтрализуют ее до воды. Если живой организм подвергся действию ионизирующего излучения, количество свободных гидроксильных радикалов резко увеличится. Кроме гидроксида кислорода и другие его активные формы могут выступать инициаторами запуска процесса перекисного окисления липидов.
Продукты перекисного окисления липидов либо утилизируются организмом, либо используются для синтеза простагландинов (веществ, участвующих в реакциях воспаления), тромбоксанов (входят в каскад тромбообразующих реакций), гормонов надпочечников.
В зависимости от базовой структуры мембраны клетки скорость, активность и количество получившихся продуктов окисления могут варьироваться. Так, например, активность перекисного окисления липидов выше там, где в составе клеточной стенки преобладают и медленнее, если основой КС является холестерин. Кроме того, фактором, регулирующим количество и скорость образования свободных кислородных радикалов, а также утилизацию перекисей, являются метаболические ферменты. Еще в реакции перекисного окисления липидов принимают участие вещества, влияющие на липидный состав мембраны клетки и его произвольное изменение в соответствии с потребностями организма. К ним относятся витамин Е и К, тироксин (гормон щитовидной железы), гидрокортизон, кортизон и альдостерон (по принципу обратной связи). Дестабилизируют клеточную стенку ионы металлов, витамины С и D.
Метаболические продукты перекисного окисления липидов могут накапливаться в тканях и жидкостях организма, если антиоксидантная система не успевает утилизировать их с необходимой скоростью. Вследствие этого нарушается транспорт ионов через мембрану клетки, что опосредованно может влиять на ионный состав жидкой части крови, скорость поляризации и деполяризации мембран мышечных клеток (нарушать проводимость нервных импульсов, их сократимость, увеличивать рефрактерный период), способствовать выходу жидкости во внеклеточное пространство (отеки, сгущение крови, нарушение электролитного баланса). Кроме того, основные продукты перекисного окисления липидов, после ряда биохимических реакций, превращаются в альдегиды, кислоты и пр. Эти вещества оказывают токсическое влияние на организм, проявляющееся в снижении скорости синтеза ДНК, повышении проницаемости капилляров, повышении онкотического давления и, как следствие, сладж-синдроме.
Практикующим специалистам необходимо помнить, что проведение диагностических и лечебных процедур может активировать механизм перекисного окисления липидов. Об этом следует предупредить пациента. К провоцирующим факторам относятся лучевая терапия (при онкологии), ультрафиолетовое облучение (при рахите, воспалительных заболеваниях пазух носа, антибактериальной обработке помещений), магнитные поля (МРТ, КТ, физиотерапия), сеансы в барокамере (при полиомиелите,
Персоналу, работающему в рентгенкабинетах, санитаркам и медсёстрам, специалистам по физиотерапии, альпинистам, людям с избыточным весом нужно употреблять в пищу продукты, содержащие естественные антиоксиданты: рыбу, подсолнечное или оливковое масло, зелень, яйца, зеленый чай.
Помимо изменения диеты, можно использовать лекарственные средства, которые связывают некоторые группы свободных радикалов или соединяются с металлами переменной валентности. Таким образом они замещают свободные молекулы активного кислорода, не давая им связываться с усилителями ПОЛ.
На нынешнем этапе развития лабораторных исследований мы имеем возможность обнаружить перекиси в составе биологических жидкостей организма человека. Для этого нужно провести Проще говоря, выявить перекисное окисление липидов. Значение этого диагностического теста не нуждается в объяснении. Ведь в основе значительного количества заболеваний лежит чрезмерная активность перекисного окисления липидов. Выявление этого состояния определяет тактику лечения.
С точки зрения нормальной физиологии перекисное окисление липидов необходимо для образования стероидных гормонов, цитокинов и тромбоксанов. Но когда количество продуктов обмена данных химических реакций превышает допустимое значение и перекиси повреждают органеллы клетки, нарушают синтез ДНК и белков, в действие вступает антиоксидантная система, снижающая количество свободных радикалов кислорода, ионов металлов с изменчивой валентностью. Кроме этого, она повышает синтез каталазы и пероксидазы с целью утилизации излишков перекисей и продуктов их дальнейшего метаболизма.
УДК 547.1-3(612.015.11)
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ ПРИ ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ. Сообщение II1
М.Г. Узбеков
Московский научно-исследовательский институт психиатрии - филиал ФГБУ «ФМИЦПН им. В.П. Сербского» Минздрава России
Механизм перекисного окисления липидов
Принцип процесса. Липиды могут окисляться как in vitro, так и in vivo. Однако аутоокисление липидов в живом организме является медленным процессом. Но, если создаются условия, при которых липиды могут подвергнуться свободно-радикальной атаке, то они теряют атом водорода, переходят в свободно радикальную форму (L^) и с легкостью взаимодействуют с молекулярным кислородом, то есть переокисляются (LO^). Этот процесс и называется перекисным окислением липидов (ПОЛ). Особенно чувствительны к перекисному окислению полиненасыщенные жирные кислоты - кислоты с большим числом ненасыщенных связей в их углеродной цепочке. Они служат наилучшим субстратом для перекисного окисления благодаря наличию в их структуре бис-аллильной метиленовой группы, СН2. Углерод-водородная связь в этой активированной а-метиленовой группе, которая находится в последующем положении за двойной связью (СН=СН-СН2), имеет более низкую энергию диссоциации связи, чем в других группах, и является прекрасной мишенью для свободных кислородных радикалов. Поэтому, начальной стадией ПОЛ является удаление атома водорода от этого углеродного атома полиненасыщенной жирной кислоты при взаимодействии со свободным радикалом ( OH) .
Процессы ПОЛ в биологических системах.
Окисление липидов в биологических системах протекает в виде цепной реакции, состоящей из трех фаз: инициации цепной реакции, продолжения цепной реакции и обрыва (или завершения) цепной реакции. Многие стадии этого процесса изучены недостаточно полно, но в целом процесс перекисного окисления липидов представляется в следующем.
1. Во время фазы инициации свободный кислородный радикал (инициатор), преимущественно ОН, взаимодействует с жирной кислотой (LH), имеющей ненасыщенные связи (т.е. с полиненасыщенными жирными кислотами, ПНЖК).
2. А). Свободный радикальный инициатор отделяет атом водорода от углеродного атома, соседнего с двойной связью
Сн2-сн=сн-сн2- ^ -СН2-СН=СН-СН-- + н
при этом углеродном атоме формируется радикальный центр. Таким образом, из жирной кислоты образуется алкильный радикал (Ь^). Инициатор, присоединяя атом водорода, перестает быть свободным радикалом.
Б). Фаза инициации сопровождается рядом немедленных конфигурационных изменений исходной молекулы жирной кислоты:
Перенос свободного электрона на другие углеродные атомы;
Это приводит к тому, что двойные связи располагаются ближе друг к другу, что ведет к образованию конъюгированных двойных связей; последнее является признаком ранней стадии свободно-радикального повреждения ПНЖК и может быть выявлено при помощи спектрофотометрических методов;
Некоторые двойные связи принимают 1гап8-конфигурацию вместо е18-конфигурации, характерной для исходной, неповрежденной молекулы жирной кислоты.
Следующие реакции относятся к фазе продолжения цепной реакции.
3. К алкильному радикалу (Ь^) присоединяется О2, в результате чего образуется пероксильный радикал (ЬОО*).
4. Пероксильные радикалы (ЬОО^) отделяют водородный атом от близлежащих молекул, которые могут быть другими полиненасыщенными жирными кислотами, белками или нуклеиновыми кислотами, в результате чего образуются метастабильные (неустойчивые) липидные гидропероксиды (ЬООН).
Антиоксиданты, такие как а-токоферол (а-ТОФ, витамин Е), могут служить прекрасными донаторами атомов водорода. Их взаимодействие с перок-сильными радикалами (ЬОО^) ведет к образованию липидных гидропероксидов (ЬООН) и сравнительно
1 Сообщение I см. Социальная и клиническая психиатрия. 2014. Т. 24, № 4. С. 97-103
инертных а-токоферол-феноксильных радикалов (а-ТО^). В отсутствие антиоксидантов или других ингибиторов ПОЛ пероксильные радикалы (ЬОО^) могут отделять атом водорода от другой молекулы липида (LH), продуцируя другой высоко активный алкильный радикал (L^), который затем продолжает другую цепную реакцию.
5. Липидный гидропероксид ^ООН) способен к спонтанной декомпозиции на алкоксильный радикал (LO^) и гидроксильный радикал ( ОН)
Если перекисное окисление липидов катализируется металлами с переменной валентностью (железо или медь), то декомпозиция липидных гидроперок-сидов (LООH) сопровождается продукцией алкок-сильных (LО ) и пероксильных (LОО ) радикалов и гидроксильного и водородного ионов. Все эти радикалы при взаимодействии с другими жирными кислотами (LH) способны инициировать новые радикальные цепные реакции. (При этом вышеперечисленные радикалы, присоединяя атомы водорода, восстанавливаются и, таким образом, прекращают свое свободно-радикальное существование). Такой процесс in vivo не может протекать неопределенно долго, однако, установлено, что при выраженном дефиците витамина Е цепные реакции ПОЛ в мембранах эритроцитов протекают патологически долго, как пишут авторы - «тревожаще долго» .
6. Алкоксильный радикал (LO^) при продолжении свободно-радикальной атаки может распадаться с образованием альдегидов и алкильных радикальных фрагментов.
Фаза обрыва (или завершения) цепной реакции
протекает следующим образом.
7. Алкильные радикалы (L^) могут взаимодействовать с окружающими радикалами (например, с алкок-сильными радикалами (LO»), и на этом процесс пере-кисного окисления липидов завершается в результате образования кислородных мостиков между этими радикалами или алкильные радикалы образуют С-С связи с другими алкильными радикалами. Образовавшиеся соединения являются относительно инертными и не обладают свободно-радикальной активностью, но эти вещества являются высоко токсичными.
При физиологических условиях аутоокисление ПНЖК является очень медленным процессом. Однако при патологических условиях оно ускоряется, становится более интенсивным и может повреждать все основные макромолекулы. Соединения, образующиеся в процессе ПОЛ: липидные пероксиды, малоновый диальдегид, 2-алкеналы, 4-окси-2-алкеналы, главный побочный продукт перекисного окисления арахидоновой кислоты - 4-оксиноненал, липидные эпоксиды, благодаря своей сравнительной стабильности, могут проникать в достаточно отдаленные части клетки или других клеток. Поэтому, процесс ПОЛ может вызывать повреждения клеток и тканей, которые не подвергались прямому воздействию окислительного процесса.
Чувствительность каждой в отдельности полиненасыщенной жирной кислоты к перекисному окислению повышается с увеличением числа ненасыщенных связей в углеродной цепочке липида. Главными жирными кислотами, которые подвергаются перекисному окислению в клеточных мембранах, являются линолевая (18:2), арахидоновая (20:4), докосагексаеновая (22:6) и ряд других кислот (в приведенных отношениях первая цифра означает число углеродных атомов в молекуле жирной кислоты, вторая цифра - число ненасыщенных связей). Если перекисному окислению подвергаются 18:2-, 20:4-, 22:6- жирные кислоты, то, соответственно, образуется 2, 6 или 10 различных гидро-пероксидов (ЬООН) .
Процесс перекисного окисления липидов является главным источником различных цитотоксиче-ских продуктов, например, альдегидов. Малоновый диальдегид (МДА) образуется в результате перекис-ного окисления жирных кислот, содержащих три или более двойных связей (линоленовая и арахидоновая кислоты, соответственно). Реакция МДА с первичными аминами приводит к образованию шиффовых оснований. Имеются предположения, что пигменты, откладывающиеся при старении (липофусцин), являются результатом аккумуляции в лизосомах нерастворимых конъюгированных шиффовых оснований, образованных в реакции МДА с липидами и белками. МДА может способствовать перекрестному связыванию и полимеризации компонентов мембран, повреждая их важнейшие свойств и функций, такие как текучесть, ионный транспорт, ферментативная и рецепторная активности, аггрегирующая способность детерминантов клеточной поверхности и другие. МДА может также связываться с азотистыми основаниями ДНК. Вышесказанное объясняет, почему малоновому диальдегиду приписывается роль мутагенного, генотоксического и канцерогенного соединения .
Процессы восстановления липидных компонентов мембран. Продукты ПОЛ модифицируют физико-химические характеристики биологических мембран. Например, включение ЬООН изменяет физическую структуру мембран и повреждает их фундаментальные свойства - текучесть и проницаемость, что в конечном итоге ведет к нарушению их многочисленных функций. После прекращения свободно-радикальной атаки для восстановления поврежденной мембраны необходимо удалить из нее продукты ПОЛ. Процесс восстановления сопровождается действием двух раздельных ферментативных систем: 1) последовательным действием фосфолипазы А2 и глутатион-пероксидазы и 2) фосфолипидгидропероксид-глутатион-пероксидазы .
Процесс перекисного окисления липидов активирует фосфолипазы. Фосфолипаза А2 (РЬА2) проявляет субстратную специфичность в отношении
переокисленных фосфолипидов мембран и катализирует гидролиз фосфолипидных пероксидов в гидропероксиды жирных кислот. После высвобождения последние подвергаются действию глутатион-пероксидазы и в результате образуются стабильные восстановленные гидрокси-соединения. Эти реакции способствуют обрыву процесса ПОЛ.
Вторая ферментативная система удаляет фосфоли-пидные гидропероксиды из липидов мембран путем прямой реакции между фосфолипидгидропероксид-глутатион-пероксидазой и эстерифицированными фосфолипидными гидропероксидами. Это восстановление in situ фосфолипидных гидропероксидов в фосфолипидные гидроксиды, все еще находящихся в структуре мембраны, также способствует завершению процесса ПОЛ.
Затем благодаря работе двух антиоксидантных систем, включающих в себя а-токоферол и аскорбиновую кислоту (см. ниже), происходит удаление радикалов и их продуктов из липидной фазы в водную среду.
Роль ионов металлов c переменной валентностью в свободно-радикальных процессах
Среди металлов с переменной валентностью, которые могут участвовать в реакциях, связанных с метаболизмом кислорода, главными являются железо и медь.
Железо играет очень важную роль в организме человека и животных; от него зависит транспорт (гемоглобин), хранение (миоглобин), и использование (цитохромы, цитохромоксидаза, негемовые железо-содержащие белки) кислорода для дыхания. Оно также является абсолютно необходимым компонентом активных центров многих ферментов (акони-таза, пролин-гидроксилаза), включая фермент анти-оксидантной защиты - каталазу.
Железо способно с большой скоростью акцептировать и отдавать электроны, превращаясь, соответственно, в двухвалентную (Fe2+) или трехвалентную (Fe3+) формы. Именно эта способность железа делает его абсолютно необходимым компонентом указанных выше белков.
Железо (Fe) является важнейшим элементом практически для всех типов клеток, включая и нервные клетки. Единственным исключением являются представители семейства Lactobacillus и Bacillus, которые поддерживают жизнь без железа. Способность железа к окислительно-восстановительной реакции между Fe(II) и Fe(III) формами широко используется во многих биологических процессах. Как компонент гемма железо участвует в транспорте кислорода гемоглобином и детоксикации лекарственных препаратов при помощи цитохрома P450 в печени. Находясь в кластере белков в связанном с серой состоянии, железо способствует прохождению электронов в митохондриальной цепи терминального окисления
с образованием аденозинтрифосфата. Входя в состав рибонуклеотид-редуктазы, железо является важным фактором в синтезе ДНК. Кроме того железу приписывается важная роль в иммунном ответе .
К сожалению, окислительно-восстановительная способность железа способствует активации продукцию свободных радикалов - гидроксильного и супероксидного радикалов:
Бе2+ +02^Бе3++02- (1)
202- + Н+ ^ 02 + Н202 (2)
Бе2+ + Н202 ^ Бе3+ + 0Н- + ЮН (3)
При нейтральном значении рН и физиологических значениях напряжения кислорода Бе2+ очень быстро окисляется в Бе3+ с образованием супероксидного радикала (О2^_) (реакция 1). Под действием суперок-сиддисмутазы две супероксидные молекулы превращаются в кислород и перекись водорода (Н202) (реакция 2). Перекись водорода в реакции Фентона переводит Бе2+ в Бе3+ с образованием гидроксиль-ного радикала (*0Н) (реакция 3). Образовавшиеся свободные радикалы - супероксидный и гидрок-сильный - могут атаковать липиды, белки и нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК).
С одной стороны Бе2+ является высоко токсичным металлом, а с другой, низкая растворимость Бе3+ при физиологических значениях рН представляет собой ещё одно препятствие для включения железа в биологические системы. При нейтральных значениях рН и физиологических значениях напряжения кислорода Бе2+ очень быстро окисляется в Бе3+. При этих условиях Бе3+ гидролизуется и образует практически нерастворимый Бе(0Н)3 комплекс. Всё это делает малодоступным для организма такой широко распространенный металл. С этим связана ситуация, что около 66-88 % населения земного шара испытывает дефицит железа .
При нормальных физиологических условиях, вопреки популярному мнению, супероксидный радикал, О2^_ , не способен окислять подавляющее большинство органических соединений. Н2О2, являясь очень сильным окисляющим агентом, очень медленно взаимодействует с органическими веществами. Каким же образом при свободно-радикальной атаке повреждаются различные биохимические механизмы и клеточные структуры? В значительной степени ответ заключается в том, что ионы железа, катализируя реакции, в которых участвуют О2^_ и Н2О2, способствуют превращению их в более агрессивные свободные радикалы, например, в гидрок-сильный радикал. Это было установлено с использованием самого чувствительного на железо блеоми-цинового метода .
В биологических системах ионы железа никогда не находятся в абсолютно свободной форме. Любое количество высвободившегося Бе2+ немедленно образует в клетке хелаты с молекулами ряда органических соединений, например, с цитратом или аденозиндифосфатом. Такие хелаты и представ-
ляют собой так называемое «свободное железо» или «лабильное железо», которое, участвуя в реакциях Хабер-Вейсса и Фентона, способствует генерации ОН (см. уравнения 2 и 3, соответственно, Сообщение I), . Гидроксильный радикал способен отделять атом водорода из полиненасыщенных жирных кислот и начинать перекисное окисление липидов. Однако, для этого процесса абсолютно необходимы металлы с переменной валентностью, даже если он инициируется таким мощным и агрессивным свободным радикалом, как ОН. Так, Мтой1 О. и Аш1 8. , используя Н2О2 и препараты липосом, установили, что в отсутствие ионов металлов с переменной валентностью невозможно инициировать ОН-активированное перекисное окисление липидов и что для ПОЛ необходимо оптимальное соотношение Бе3+ к Бе2+, равное 1:1.
Вовлечение железа в процесс ПОЛ не ограничивается только инициацией процесса. Последующее распространение процесса ПОЛ также требует участия железа. Ионы железа активируют расщепление образующихся липидных гидропероксидов (ЬООН), которые превращаются в другие свободные липидные радикалы, такие как пероксильные (ЬОО^) и алкоксильные (ЬО^) радикалы:
ЬООН+Бе3+ ^ ЬОО^+Бе2+ или
ЬООН+Бе2+ ^ ЬО^+Бе3+
В результате накапливающиеся свободные низкомолекулярные и липидные радикалы могут повреждать практически все органические молекулы (белки, липиды, нуклеиновые кислоты и т.д.) и все биологические структуры.
Этим объясняется та угроза, которую несет «свободное железо» или «лабильное железо» в процессе жизнедеятельности. Избыточная продукция О/- и Н2О2, то есть оксидативный стресс, который имеет место при многих патологических ситуациях, включая все инфекционные заболевания и воспалительные процессы и все болезни, сопровождающиеся ишемией и реперфузией, повышает высвобождение «свободного железа» из мест хранения, например, ферритина .
Живые организмы защищены от оксидативного стресса и повреждений, катализируемых железом, при помощи двух механизмов. Во-первых, чтобы предотвратить свободно-радикальную атаку, железо связывается белками. Во-вторых, для предотвращения избыточного захвата железа в местах хранения, в организме существуют тонкие механизмы его регуляции, накопления и хранения.
У взрослого мужчины в норме содержится от 35 до 45 мг железа на кг веса тела. У женщин до менопаузы содержание железа ниже вследствие повторяющихся потерь крови при менструациях. 80% от общего количества железа в организме сосредоточено в гемоглобине развивающихся предшественников эритроцитов и в зрелых эритроцитах. От 10
до 15% железа находится в миоглобине мышц, а остальное его количество - в различных ферментах и других белках.
Железо транспортируется в плазме в комплексе с трансферрином - белком с молекулярной массой 80 кДальтон, который имеет два центра связывания железа. Взрослый человек весом 75 кг имеет в плазме около 3 мг железа, практически всего связанного с трансферрином. Плазма крови поставляет клеткам около 30 мг железа в день.
Регуляция абсорбции железа в кишечнике имеет чрезвычайно важное значение как для оптимального процесса эритропоэза, так и для функционирования организма в целом. Эта регуляция является критическим моментом потому, что у человека нет физиологических путей экскреции железа, за исключением повторяющихся потерь крови при менструациях у женщин и десквамации клеток эпителия двенадцатиперстной кишки (жизненный цикл клеток эпителия составляет приблизительно 35 час.).
Все железо, поступающее в организм, абсорбируется только клетками эпителия ворсинок двенадцатиперстной кишки на небольшом участке, прилегающем к желудку. Внутри эпителия судьба железа может быть двоякой: оно может храниться в связанном с ферритином состоянии или может транспортироваться через базальную мембрану в плазму. Детерминирующим судьбу железа фактором является программа, которая была заложена в клетку, когда она проходила цикл развития в виде клеток крипт. Железо, которое остается в форме ферритина, задерживается в эпителии, который по завершению своего жизненного цикла слущивается и выводится из организма.
Другая часть железа транспортером двухвалентных металлов переносится через эпителиальную клетку на базальную мембрану. На базальной мембране железо передается другому специальному белку -транспортеру, который был недавно охарактеризован и назван ферропортином. Процесс переноса железа через базальную мембрану является очень сложным и, кроме вышеуказанного, требует еще одного дополнительного медь-содержащего белка - хепэстина, обладающего ферроксидазной активностью. Следует отметить, что железо, идущее на синтез гемоглобина, захватывается в клетках эпителия при помощи какого-то иного, еще слабо охарактеризованного механизма.
Железо, попадая в плазму, сразу же связывается с трансферрином и переносится в места хранения, которыми служат гепатоциты печени и макрофаги. Макрофаги переваривают состарившиеся эритроциты, расщепляют гемоглобин, захватывают железо и перегружают его на трансферрин для повторного использования.
Железо, как уже отмечалось, хранится в клетке в форме ферритина . Молекула ферритина обладает значительной мощностью для связывания больших
количеств железа и способностью хранить его в нетоксичной, растворимой трехвалентной форме. Ферритин состоит из ядра, в котором может находиться до 4500 атомов железа, и апопротеиновой оболочки или апоферритина, массой в 445 кДальтон, которая окружает ядро. Обычно в ферритине содержится около 2500 ионов железа, находящихся в сложном комплексе - [Бе0(0Н)8, БеР04^Н20], основную часть которого составляют изополиос-нования - [Бе0(0Н)]х. Ферритин синтезируется во всех без исключения клетках организма, но, прежде всего в гепатоцитах и макрофагах. Молекула апофер-ритина состоит из 24 субъединиц в виде двух структурно различных типов: тяжелого (Н) типа массой в 21 кДальтон и легкого (Ь) типа массой в 19 кДальтон. Различное процентное соотношение каждого типа субъединиц в молекуле ферритина способствует возникновению изоферритинов, которые имеют специфическое распределение по тканям. Соотношение между Ь- и Н-субъединицами может регулировать высвобождение «свободного железа».
Мы не будем более подробно останавливаться на вопросах хранения железа и регуляции клеточного гомеостаза железа; по этим вопросам имеется обширная литература . Хотелось бы только отметить, что у мужчин на протяжении всей жизни, а у женщин в период постменопаузы содержание железа в местах хранения увеличивается почти линейно в соответствии с возрастом. Это дает дополнительный вклад в риск возникновения заболеваний, таких как атеросклероз, хронические воспалительные заболевания или злокачественные новообразования, в патогенезе которых оксидативный стресс играет важную роль .
Медь, благодаря своим физико-химическим свойствам, занимает одно из ведущих мест в обмене веществ. Захватывая или теряя электрон (при изменении валентности), ион меди может служить как донором, так и акцептором электронов в окислительно-восстановительных реакциях; например, в реакциях, катализируемых цитохромок-сидазой. Медь нужна для синтеза медь-содержащих белков и ферментов. Она входит в состав активных центров множества ферментов - цитохромоксидазы, галактозидазы, дофамин-Р-гидроксилазы, суперок-сиддисмутазы, ксантиноксидазы и других. Медь участвует в обмене железа .
В организме взрослого человека содержится 100-150 мг меди, ее находят практически во всех органах и тканях. В крови содержится около 100 мкг% меди. В эритроцитах и лейкоцитах в составе находящейся там супероксиддисмутазы находится около 60 мкг% меди. С пищей человек получает 2-5 мг меди, из которых усваивается не более 30%. Всасывается медь в основном в тонком кишечнике. В эпителии слизистой оболочки имеется белок - метал-лотионеин, который образует с медью комплекс, который переносит ее в плазму.
В отличие от железа у меди имеются физиологические пути ее выведения из организма. Основная часть меди (до 80%) выводится желчью через кишечник и с мочой, соответственно, около 16 и 4% меди. Незначительное количество меди может также выводиться с потом.
Практически вся всосавшаяся в плазму крови медь (более 98%) находится в связанной с церуло-плазмином форме.
Другим важным белком плазмы крови, наряду с трансферрином, который принимает участие в обмене металлов с переменной валентностью и, таким образом, вовлекается в свободно-радикальные процессы, является церулоплазмин. Он является медь-связывающим гликопротеином с молекулярной массой в 130 кДальтон. При физиологических условиях церулоплазмин связывает 6-7 ионов меди на молекулу. Медь является прооксидантным катализатором, который активирует реакции образования гидроксильных радикалов из перекиси водорода или супероксидного радикала. Однако тонкие молекулярные механизмы его обмена и формы участия в процессах ПОЛ изучены очень слабо. Так, например, B.H.Halliwell указывает, что мозг содержит медь, но отсутствует какая-либо информация о ее молекулярной природе и о том, где находятся места ее хранения и как происходит ее мобилизация для активации свободно-радикальных реакций.
Считается, что функционально церулоплазмин проявляет антиоксидантные свойства. Во-первых, связывание меди церулоплазмином снижает ее проок-сидантные свойства. Во-вторых, роль церулоплаз-мина как антиоксиданта объясняется его свойствами как нейтрализатора свободных радикалов, например, супероксидного радикала. Хотя эта нейтрализующая активность выражена слабее, чем у супероксид-дисмутазы, она может, как считают, играть значительную роль в антиоксидантной защите во внеклеточных компартментах . В-третьих, имеется ряд данных, что церулоплазмин обладает феррокси-дазной активностью, катализирующей окисление Fe2+ в Fe3+ и что, благодаря этой активности, происходит загрузка Fe3+ в ферритин и на трансферрин .
Методы выявления свободно-радикальной активности в организме
Приведем краткий обзор ряда методов (естественно не всех), применяемых для детекции свободных кислородных радикалов, веществ, отражающих выраженность перекисного окисления липидов, а также компонентов антиоксидантной защиты. Более подробную информацию по этому вопросу можно почерпнуть в специальной литературе .
Изучение свободных радикалов представляет значительную трудность, связанную с их низкой стационарной концентрацией in vivo, являющейся следствием их высокой химической активности.
Однако к настоящему времени разработаны методы, позволяющие дать прямую характеристику кислородных радикалов; к ним относятся следующие:
1) метод электронно-парамагнитной резонансной (ЭПР) спектроскопии;
2) метод спиновых ловушек с дальнейшим использованием ЭПР-спектроскопии;
3) метод темновой хемилюминисценции (для выявления синглетного кислорода);
4) спектрофотометрический метод, основанный на реакции восстановления супероксидным радикалом цитохрома до ферроцитохрома (О2^- выступает в качестве восстановителя);
5) спектрофотометрический метод, основанный на восстановлении супероксидным радикалом нитро-синего тетразолия до формазана (О2^- выступает в качестве восстановителя);
6) спектрофотометрический метод окисления супероксидным радикалом адреналина (О2^- выступает в качестве окислителя);
7) спектрофотометрический метод, основанный на определении скорости окисления НАДФН (для выявления Н2О2);
8) метод выявления ОН при помощи салицилата, который является их высокоэффективной и селективной ловушкой. При их взаимодействии образуются аддукты бензойной кислоты, которые определяются методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией.
Так как прямой анализ эндогенных первичных продуктов перекисного окисления липидов представляет большие трудности, то обычно выраженность ПОЛ оценивают путем определения вторичных продуктов процессов окисления. Для оценки состояния процесса ПОЛ используют различные методы; укажем на ряд из них:
1) метод определения антиокислительной активности (АОА) с использованием метилолеатной модели по торможению реакции термического окисления метилового эфира олеиновой кислоты;
2) метод определения уровня малонового диаль-дегида при помощи тиобарбитуровой кислоты. Пере-кисное окисление жирных кислот, содержащих три или более двойных связей, ведет к образованию гидроперекисей. Последние подвергаются декомпозиции с образованием вторичных продуктов, и в частности, малонового диальдегида. Хотя это соединение не является специфическим продуктом перекисного окисления жирных кислот, тем не менее, его содержание коррелирует со степенью выраженности ПОЛ;
3) реакция малонового диальдегида с первичными аминами дает флуоресцирующие конъюгированные Шиффовы основания, которые определяются спек-трофлуориметрически при 470 нм после возбуждения при 365 нм. Продукт вышеуказанной реакции является хорошим коррелятом ПОЛ;
4) спектрофотометрическим методом оценки выраженности ПОЛ является определение при 230-235 нм
уровня конъюгированных диенов, которые образуются из полиненасыщенных жирных кислот;
5) определение уровня полиненасыщенных жирных кислот методом газо-жидкостной хроматографии, а также содержания витамина E и восстановленного глутатиона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии служит косвенным показателем выраженности процессов ПОЛ;
6) для определения липидных гидропероксидов в крови используются иодометрический метод, ксиленол-оранжевый метод или ультрафиолетовая спектрофотометрия;
7) Выраженность перекисного окисления липидов может быть охарактеризована при количественном определении этана и пентана в выдыхаемом воздухе. Эти летучие углеводороды являются побочными продуктами обмена гидропероксидов в клетке и могут быть определены при помощи чувствительного (и неинвазивного) метода газожидкостной хроматографии. При этом предпочтительнее определение этана, т. к. он, в отличие от пентана, не мета-болизируется в печени;
8) Определение активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион-пероксидазы, глутатион-редуктазы - в форменных элементах крови и жидкостях организма является косвенным показателем интенсивности и тяжести свободно-радикальных реакций и процессов ПОЛ или состояния антиоксидантной защиты;
9) Микроэлементы - селен, цинк, медь, марганец -являются абсолютно необходимыми кофакторами антиоксидантных ферментов. Их определение методами атомно-абсорбционной спектрометрии дает информацию об антиоксидантном статусе организма.
Малоновый диальдегид (МДА) составляет приблизительно 70% от общего количества альдегидов, образующихся при перекисном окислении липидов мембран . Одним из самых давно употребляемых, простых и широко распространенных методов определения МДА является тиобарбитуровый метод . Однако тиобарбитуровая кислота вступает в реакцию и с другими соединениями, не связанными с процессами ПОЛ. Они могут давать вклад в общую величину абсорбции, что не соответствует реальной концентрации МДА in vivo, а более относится к сумме так называемых TBARS соединений (TBARS - substances reacting with thiobarbituric acid, вещества, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой). Тиобарбитуровый метод часто критикуют за недостаточную специфичность по отношению к МДА. Однако, несмотря на критику, этот метод до настоящего времени остается одним из самых востребованных и часто применяемых методов .
Молекулярные мишени свободных радикалов
Белки и свободные радикалы. В литературе накапливается все большее количество данных, что белковые молекулы подвергаются значительной
модификации под действием свободных радикалов. Чувствительность белков к повреждающему действию зависит от их аминокислотного состава, от локализации и функциональной важности аминокислот, определяющих конформацию белковой молекулы и ее активность, а также подверженность к окисляющему действию оксидантов. В этой ситуации важную роль играет способность поврежденного белка самостоятельно ликвидировать нарушения (например, восстановить образовавшиеся дисульфидные связи). Клеточная локализация белков и природа воздействующего свободного радикала также влияют на выраженность повреждения этих макромолекул .
Известно, что молекулы, содержащие ненасыщенные связи, а также серу-содержащие соединения с готовностью реагируют со свободными радикалами. Поэтому аминокислотные остатки триптофана, тирозина, фенилаланина, гистидина, метио-нина и цистеина, относящиеся к вышеуказанным типам молекул и входящие в состав белков, могут подвергаться модификации под действием окси-дантов. Например, такие ферменты, как папаин и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, чья активность зависит от этих аминокислотных остатков, инги-бируются при действии свободных радикалов .
В последние годы было выявлено, что ряд ферментов, у которых в активном центре имеются кластеры железо-сера, очень чувствителен к инак-тивирующему действию О2^_. Так, аконитаза митохондрий человека инактивируется под действием свободных радикалов как in vitro, так и in vivo, что усиливает генерацию О2^_ в митохондриях. Так как аконитаза участвует в цикле трикарбоновых кислот (цитратном цикле), то ее ингибирование может иметь полидирекционные (плейотропные) эффекты. Более того, торможение активности аконитазы под действием О2^_ инициирует механизмы, способствующие высвобождению свободного железа из состава фермента. Это наблюдение явилось основанием для выдвижения гипотезы о токсическом действии супероксидного радикала на генетический аппарат .
В отличие от липидов и нуклеиновых кислот белки представляют собой очень разнообразную группу высокомолекулярных соединений - мишеней для свободно-радикальной атаки. Наверное, этим обусловлено то, что в настоящее время различия между белками по их чувствительности к действию оксидантов изучены очень слабо. Имеющиеся результаты в основном связаны с исследованием чувствительности белковых пептидных цепей и отдельных аминокислот к свободным радикалам. Так, детальное сравнительное количественное исследование бычьего сывороточного альбумина и глутаминсинтетазы показало, что в молекуле альбумина остатки метионина и ароматических аминокислот, наиболее чувствительных к действию оксидантов, окисляются приблизительно в 2 раза
быстрее, чем те же остатки аминокислот в молекуле глутаминсинтетазы. Эти факты свидетельствуют о том, что все четыре уровня организации белковой структуры чувствительны к окисляющему действию свободных радикалов .
Нельзя исключить такую возможность, что избирательная чувствительность белков к окисляющему действию свободных радикалов может явиться тем краеугольным камнем, который обусловливает нарушение гомеостаза и определенную биохимическую специфичность различных патологических процессов.
В результате взаимодействия свободных радикалов с белками могут генерироваться побочные продукты, которые утяжеляют повреждение, вызываемое начальной реакцией. Например, окисление остатка триптофана ведет к образованию Н2О2 и К-формилкинуренина. Последний, взаимодействуя с соединениями, содержащими амино-группы, образовывает шиффовы основания. Тем самым под его воздействием могут формироваться перекрестные связи между липидами и/или белками. В то же время перекись водорода может реагировать непосредственно с клеточными компонентами или инициировать новые реакции, в которых генерируются дополнительные свободные радикалы .
В своей работе Б.Р.Уи попытался сгруппировать физико-химические изменения, происходящие в белковых молекулах под действием оксидантов, на три категории: 1) фрагментация, 2) агрегация и 3) изменение чувствительности к действию протео-литических ферментов.
1). Фрагментация различных белков, в частности альбумина, коллагена и у-глобулинов, происходящая под действием свободных радикалов, подтверждается значительным числом работ . Повреждение молекул коллагена и альбумина при свободно-радикальной атаке происходит избирательно на уровне остатков пролина, так как пролин обладает повышенной чувствительностью к действию гидрок-сильного радикала. Отмечается также избирательная атака ОН радикалов на остатки гистидина и аргинина. Это обусловлено тем, что указанные аминокислоты бывают часто связаны с металлами с переменной валентностью (железо и медь), которые служат в этом случае катализаторами дальнейшей генерации ОН.
2). Окислительное повреждение ведет к агрегации белков путем денатурации, что, например, показано для белков хрусталика и церулоплазмина. Агрегация белков может быть вызвана действием ОН, который инициирует образование перекрестных связей между макромолекулами. Электрофорез в полиакрила-мидном геле, предназначенном для исследования белков с различной молекулярной массой, показал, что эти агрегаты состоят из нативных перекрестно сшитых белков, а не из фрагментированных частей белков, образующих неспецифические агрегаты .
Цитоплазматические и мембранные белки после воздействия окисляющих агентов, например, озона или протопорфирина IX, образуют димеры или агрегаты еще больших размеров. Перекрестная сшивка таких белков происходит за счет или образования межбелковых дисульфидных мостиков (связей) или необратимого взаимодействия между аминокислотными остатками, модифицированными после свободно-радикальной атаки .
3). Так как окисление вызывает большие конфор-мационные нарушения в белковых молекулах, то такие измененные белки становятся более чувствительны к действию протеолитических ферментов. Такая денатурация белков повышает их переваривае-мость различными протеолитическими ферментами.
Углеводы и свободные радикалы. Успехи в химии свободных радикалов указывают, что нет ни одного органического соединения, которое бы не было подвержено свободно-радикальной атаке. В этом отношении глюкоза и другие родственные ей соединения не являются исключением. При изучении окисления глюкозы, было установлено , что углеводные соединения с а-оксиальдегидной структурой в присутствии ионов металлов с переменной валентностью подвергаются процессу енолизации и превращаются в кетоальдегиды. Эти авторы показали, что in vivo при физиологических условиях под действием свободных радикалов простые моносахариды могут с достаточной легкостью аутоокисляться с образованием дикарбонильных соединений и Н2О2. Это явление заслуживает особого внимания, потому что такие активированные молекулы могут взаимодействовать с другими молекулами, образуя новые соединения. В этом аспекте интересен факт неферментативного гликирования белков.
Этот процесс является важным и широко распространенным процессом в организме. Однако, при ряде заболеваний, особенно при диабете, этот процесс приобретает патологические черты и особенно активно протекает в почках и печени. В этом случае процесс гликирования представляет собой реакцию взаимодействия между £- аминогруппой лизина, входящего в состав белка, и окисленными сахарами, оксиальдегидами или кетоальдегидами. Образующиеся при этом шиффовы основания, модифицируют белки и формируют более стабильные, функционально не активные, гликированные соединения, называемые «Amadori products». В литературе накапливается все большее количество данных, что патологический процесс гликирования белков опосредуется свободно-радикальными процессами .
Нуклеиновые кислоты и свободные радикалы. Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) являются одним из ключевых компонентов клетки, который особенно чувствителен к окислительному повреждению. Основным оксидантом, который ответственен за повреждение ДНК, является гидроксильный радикал, так как ни Н2О2, ни пероксильные ради-
калы не могут напрямую взаимодействовать с этими макромолекулами. Гетерогенность структуры ДНК создает такие условия, что ОН может атаковать как азотистые основания, так и углеводно-фосфатные боковые цепи. Скорость взаимодействия гидроксиль-ного радикала с основаниями приблизительно в 5 раз выше, чем с боковыми цепями .
Свободно-радикальная атака азотистых оснований ДНК ведет к трем типам повреждений: гидрокси-лированию, раскрытию кольцевидной структуры основания и фрагментации. В конечном итоге образуются соединения, которые являются продуктами вторичных реакций, протекающих после начальной атаки радикалами. Атака гидроксильного радикала может вызвать более 100 повреждений в молекуле ДНК, в результате чего образуется около 20 типов поврежденных молекул ДНК. Однако основными продуктами этого повреждающего действия являются два соединения: 8-окси-2 -дезоксигуанозин (8-ОШО) и 2,6-диамино-4-окси-5-формамидопиримидин (БаруОиа) . (Мы приводим сокращения, принятые в международной литературе, чтобы при изучении этой проблемы не произошло разночтения). Оба эти соединения являются результатом воздействия ОН на дезоксигуанозин, а дифференциация между ними происходит вследствие вторичных реакций. Эти соединения могут быть обнаружены непосредственно в препаратах ДНК или в моче, и они являются маркерами свободно-радикального повреждения нуклеиновых кислот . Было проведено количественное определение 8-OНdG в цельных экстрактах ДНК из печени, почек, мозга, тонкого кишечника и яичек нормальных крыс различного возраста. Уровень поврежденной ДНК колебался от 8 до 83 азотистых остатков/106 остатков дезок-сигуанозина. Этот уровень повышался с возрастом в печени, почках и тонком кишечнике, но не изменялся в мозге и яичках .
Кроме прямого повреждающего действия ДНК, ОН инициирует образование из азотистых оснований транзиторных свободно-радикальных соединений, которые могут ковалентно связываться с другими макромолекулами, образуя межмолекулярные комплексы, например, перекрестно сшитые ДНК-белковые агрегаты. Несмотря на то, что такие комплексы были обнаружены в клетке, их значение (функциональное и патологическое) пока не уяснено.
Гидроксильные радикалы могут также атаковать углеводно-фосфатные боковые цепи ДНК, вызывая различные повреждения, включая образование участков без пуриновых оснований, которые элиминируются в процессе реакций, инициированных ОН. Индикатором такого патологического процесса является появление в моче свободных азотистых оснований.
Другим индикатором свободно-радикальной атаки боковой цепи ДНК является фрагментация дезокси-рибозы. ОН отделяет атом водорода в положении
С-4 дезоксирибозы, что ведет к окислению сахара и, в конечном итоге, к разрыву углеводной цепи. Этот процесс может сочетаться с процессом окисления второй молекулы сахара на комплементарной углеводной цепи, вследствие чего происходит разрыв обеих цепей. Разрыв цепей в молекуле ДНК является мутагенным феноменом для клетки и даже может привести к ее гибели.
Значительный объем знаний о механизмах повреждения ДНК в результате свободно-радикальной атаки было получено из радиационной химии. Было установлено, что после радиоактивного облучения клеток млекопитающих образуется значительное количество тимин-гликоля. Из пяти главных компонентов ДНК тимин и цитозин наиболее чувствительны к повреждающему действию ОН; чувствительность других компонентов (в порядке снижения) располагается следующим образом: аденин, гуанин и дезок-сирибоза.
Повреждение ДНК может быть индуцировано различными факторами - как внешними (радиация, ксенобиотики), так и внутренними (кислородные
свободные радикалы). Однако в настоящее время отсутствуют методы, которые бы могли помочь количественно оценить вклад каждого из этих факторов в процесс повреждения. Кроме того, надо иметь в виду, что чувствительность ДНК к окислительному повреждению зависит от того, находятся ли молекулы ДНК в комплексе или в виде индивидуальных молекул. Например, ДНК, закрученная в спираль, менее чувствительна к действию оксидантов, чем изолированная молекула. Все эти факторы создают значительные сложности в изучении механизмов повреждения ДНК in vivo.
Особый интерес представляет собой процесс повреждения ДНК митохондрий. Во-первых, так как митохондрии являются главным источником свободных кислородных радикалов, то ДНК открыта к действию высоких концентраций свободных радикалов. Во-вторых, в митохондриях очень слабо представлены механизмы репарации ДНК. В-третьих, митохондриальные ДНК являются основными мишенями действия многих химических канцерогенов .
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурлакова Е.Б. Изменения антиокислительной активности липидов при старении // Вопр. мед. химии. 1976. Т. 22, № 4. С. 541-546.
2. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники, серия Биофизика. 1991. Т. 29. 250 с.
3. Дюмаев К.М., Воронина Т. А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.: Издательство Института биомедицинской химии РАМН, 1995. 271 с.
4. Коробейникова Е.Н. Модификация метода определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. Дело. 1989. № 7. С. 8-10.
5. Узбеков М.Г. Перекисное окисление липидов и антиоксидантные системы при психических заболеваниях. Сообщение I // Социальная и клиническая психиатрия. 2014. Т. 24, № 4. С. 97-103.
6. Arosio P., Levi S. Cytosolic and mitochondrial ferritins in the regulation of cellular iron homeostasis and oxidative damage // Biochem. Biophys. Acta. 2010. Vol. 180. P. 783-792.
7. Beckman K.B., Ames B.N. The free radical theory of ageing matures // Physiol. Rev. 1998. Vol. 78. P. 547-581.
8. Berlett B.S., Levine R.L., Stadtman E.R. Comparison of the effects of ozone on the modification of amino acid residues in glutamine synthetase and bovine serum albumin // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 4177-4182.
9. Boyer R.F., Schori B.E. The incorporation of iron into apoferrin as mediated by ceruloplasmin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. Vol. 116. P. 244-250.
10. Dizdaroglu M., Jaruga P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA // Free Radic Res. 2012. Vol. 46. P. 382-419.
11. Dizdaroglu M., Coskun E., Jaruga P. Measurement of oxidatively induced DNA damage and its repair, by mass spectrometric techniques // Free Radic Res. 2015. Vol. 49. P. 525-548.
12. Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes // Free Radic Biol. Med. 1991. Vol. 11. P. 81-128.
13. Feher J., Csomos G., Vereckei A. Free Radical Reactions in Medicine. Berlin: Springer, 1987. 199 p.
14. Freeman B.A., Crapo J.D. Free radical and tissue injury // Adv. Biol. Disease. 1984. Vol. 1. P. 26-40.
15. Halliwell B.H. Reactive Oxygen species and the central nervous system // J. Neurochem. 1992. Vol. 59. P. 1609-1623.
16. Halliwell B.H., Gutteridge J.M. Free Radicals in Biology and Medicine. Fourth Edition. Oxford: Oxford Univ. Press, 2007. 888 p.
17. Hebbel R.P. Erythrocyte antioxidants and membrane vulnerability // J. Lab. Clin. Med. 1986. Vol. 107. P. 401-404.
18. Gambling L., Andersen H.S., McArdle H.J. Iron and copper and their interactions during development // Biochem. Soc. Trans. 2008. Vol. 36. P. 1258-1261.
19. Jacobs A.T., Marnett L.J. System analysis of protein modification and cellular responses induced by electrophile stress // Acc. Chem. Res. 2010. Vol. 43. P. 673-683.
20. Jomova K., Valko M. Advances in metal-induced oxidative stress and human diseases // Toxicology. 2011. Vol. 283. P. 65-87.
21. Kelly S.A., Havrilla C.M., Brady T.C., Abramo K.H., Levin E.D. Oxidative stress in toxicology: established mammalian and emerging piscine model systems // Environ Health Perspect. 1998. Vol. 106. P. 375-384.
22. Kohen R., Nyska A. Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification // Toxicol. Pathol. 2002. Vol. 30. P. 620-650.
23. Medina M.E., Galano A., Alvarez-Idaboy J.R. Site reactivity in the free radicals induced damage to leucine residues: a theoretical study // Phys. Chem. Phys. 2015. Vol. 17. P. 4970-4976.
24. Mehrdad R., Aghdaei S., Pouryaghoub G. Urinary 8-hydrtoxy-deoxyguanosine as a biomarker of oxidative DNA damage in employees of subway system // Acta Med. Iran. 2015. Vol. 53. P. 287-292.
25. Micronutrient Deficiencies. Available online: http://www.who.int/ nutrition/topics/ida/en/.
26. Minotti G., Aust S.D. The requirement for iron (III) in the initiation of lipid peroxidation by iron (II) and hydrogen peroxide // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. P. 1098-1104.
27. Nelson S.K., McCord J.M. Iron, oxygen radicals and disease // Adv. Mol. Cell. Biol. 1998. Vol. 25. P. 157-183.
28. Nergri M., Bellavite P., Lauciello C., Guzzo P., Zatti M. A photometric assay for hydrogen peroxide production by polymorphonuclear leucocytes // Clin. Chim. Acta. 1991. Vol. 199. P. 305-310.
29. Rauchova H., Vokurkova M., Koudelova J. Hypoxia-induced lipid peroxidation in the brain during postnatal ontogenesis // Physiol. Rev. 2012. Vol. 61, Suppl. 1. S. 89-101.
30. Salvador G.A. Iron in neuronal function and dysfunction // Biofactors. 2010. Vol. 36. P. 103-110.
31. Soh N. Recent advances in fluorescent probes for the detection of reactive oxygen species // Anal. Bioanal. Chem. 2006. Vol. 386. P. 532-543.
32. Spickett C.M., Wiswedel I., Siems W., Zarkovic K., Zarkovic N. Advances in methods for the determination ofbiologically relevant lipid peroxidation products // Free Radic Res. 2010. Vol. 44. P. 1172-1202.
33. Squier T.C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging // Exp. Gerontol. 2001. Vol. 36. P. 1539-1550.
34. Tarpey M.M., Fridowich I. Methods of detection of vascular reactive species: nitric oxide, superoxide, hydrogen peroxide and peroxynitrite // Circ. Res. 2001. Vol. 89. P. 224-236.
35. Vashchenko G., MacGillivary T.A. Multi-copper oxidases and human iron metabolism // Nutrients. 2013. Vol. 5. P. 2289-2313.
36. Vladimirov Y.A., Proskurina E.V. Free radicals and cell chemiluminescence // Biochemistry (Mosc). 2009. Vol. 74. P. 15451566.
37. Wang Y., Hodgkinson V., Zhu S., Weisman G.A., Petris M.J. Advances in the understanding of mammalian copper transporters // Adv. Nutr. 2011. Vol. 2. P. 129-137.
38. Wardman P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects // Free Radic Biol. Med. 2007. Vol. 43. P. 995-1022.
39. Yin H. New techniques to detect oxidative stress markers: mass spectrometry-based methods to detect is oprostanes as the gold standard for oxidative stress in vivo // Biofactors. 2008. Vol. 34. P. 109-124.
40. Yu B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species // Physiol. Rev. 1994. Vol. 74. P. 139-162.
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СИСТЕМЫ ПРИ ПСИХИЧЕСКИХ
ЗАБОЛЕВАНИЯХ. Сообщение II
М.Г. Узбеков
В статье (сообщение II) описан механизм перекисного окисления липи-дов, эти процессы в биологических системах, а также процессы восстановления липидных компонентов мембран. Рассматривается роль металлов с переменной валентностью - железо и медь - в свободно-радикальных процессах. Дан краткий обзор методов выявления свободно-радикальной
активности. В статье рассматривается влияние свободных радикалов на их молекулярные мишени - белки, углеводы и нуклеиновые кислоты.
Ключевые слова: свободные радикалы, механизм перекисного окисления липидов, железо, медь, методы, белки, углеводы, нуклеиновые кислоты.
LIPID PEROXIDATION AND ANTIOXIDANT SYSTEMS IN MENTAL DISORDERS. Part II
Mechanism of lipid peroxidation, these processes in biological systems and processes of re-establishment of membrane lipid components are described. The role of transient metals - iron and copper - in free radical processes is considered. A short review of methods of estimation of free
radical activity is presented. Influence of free radicals on their molecular targets - proteins, carbohydrates, nucleic acids - is considered.
Key words: free radicals, lipid peroxidation mechanisms, iron, copper, methods, proteins, carbohydrates, nucleic acids.
Узбеков Марат Галиевич - профессор, доктор медицинских наук, руководитель лаборатории патологии мозга Московского научно-исследовательского института психиатрии - филиала ФГБУ «ФМИЦПН им. В.П.Сербского» Минздрава России; e-mail: uzbekovmg@ mtu-net.ru
Активные формы кислорода (свободные радикалы)
В организме в результате окислительно- восстановительных реакций постоянно происходитгенерация активных форм кислорода (АФК) при одноэлектронном восстановлении кислорода (молекула имеет неспаренный электрон на молекулярной или внешней атомной орбите).
Источники АФК:
1) цепь тканевого дыхания (утечка электронов с восстановленного убихинона KoQH 2 на кислород);
2) реакции, катализируемые оксидазами, гемопротеинами, цитохромом Р 450 ;
3) реакции окисления в лейкоцитах, макрофагах и пероксисомах;
4) радиолиз воды;
5) под воздействием ксенобиотиков, пестицидов;
6) реакции самопроизвольного (неферментативного) окисления ряда веществ.
Супероксид-анион – является одним из наиболее широко распространенных в организме свободных радикалов:
Он образуется в клетках болезнетворных бактерий и является повреждающим фактором для мембран клеток паренхиматозных органов человеческого организма. Для лейкоцитов и макрофагов супероксид-анион является фактором бактерицидности, с помощью которого клетки инактивируют патогенные микроорганизмы.
Другой путь образования свободных радикалов – взаимодействие кислорода с металлами переменной валентности. При этом образуется пероксидныйрадикал:
Fe 2+ + O 2 + H + → Fe 3+ + HO 2
O 2 - + Н + → HO 2
Взаимодействие супероксиданиона с пероксидным радикалом (1) или одноэлектронное восстановление супероксид-аниона (2) в водной среде приводят к образованию пероксида водорода
O 2 - + НО 2 + Н + → Н 2 О 2 + О 2 (1)
О 2 - + е - + 2Н + → Н 2 О 2 (2)
Гидроксильный радикал ОН образуется при взаимодействии пероксида водорода с супероксид-анионом (1) либо с металлами (2):
Н 2 О 2 + О 2 - → ОН + ОН - + О 2 (1)
Н 2 О 2 + Fe 2+ → ОН + ОН - + Fe 3+ (2)
Кислородные радикалы обладают высокой реакционной способностью и легко вступают в химические реакции с органическими молекулами для приобретения недостающего электрона. Кислородные радикалы оказывают воздействие на различные структурные компоненты клеток: ДНК (повреждение азотистых оснований); белки (окисление аминокислотных остатков, образование ковалентных «сшивок»); липиды; мембранные структуры.
Активные формы кислорода могут отщеплять электроны от многих соединений, превращая их в новые свободные радикалы, и инициируют тем самым цепные окислительные реакции. Если в реакцию с АФК вступают ненасыщенные жирные кислоты плазматических мембран, говорят о перекисном окислении липидов.
Реакции ПОЛ являются свободнорадикальными и постоянно протекают в организме, также как и реакции образования АФК. В норме они поддерживаются на определенном уровне и выполняют ряд функций:
· индуцируют апоптоз (запрограммированную гибель клеток);
· регулируют структуру клеточных мембран и тем самым обеспечивают функционирование ионных каналов, рецепторов, ферментных систем;
· обеспечивают освобождение из мембраны арахидоновой кислоты, из которой синтезируются биорегуляторы (простагландины, тромбоксаны, лейкотриены);
· ПОЛ может выступать в качестве вторичного мессенджера, участвуя в трансформации сигналов из внешней и внутренней среды организма, обеспечивая их внутриклеточную передачу;
· АФК участвуют в клеточном иммунитете и фагоцитозе.
Механизм ПОЛ :
1) Инициация.
Инициирует реакцию чаще всего гидроксильный радикал, отнимающий водород от СН 2 - групп ненасыщенной жирной кислоты L, что приводит к образованию липидного радикала L·:
L + OН → L·2) Развитие цепи.
Развитие цепи происходит при присоединении кислорода, в результате чего образуется пероксидный радикал LOO· или пероксид липида LOOH (гидроперекиси липидов)
L· + O 2 → LOO·
LOО· + LH → LOOH + LR∙·
3) Обрыв цепи.
Развитие цепи может останавливаться при взаимодействии свободных радикалов между собой или при взаимодействии с различными антиоксидантами (витамином Е), которые являются донорами электронов:
LOO·∙ + L· → LOOH + LH
L∙·+ вит Е → LH + вит Е·∙
ВИТ Е· + L· → LH + ВИТ Е окисл
В результате ПОЛ происходит преобразование обычных липидов в первичные продукты ПОЛ (гидроперекиси липидов). Это приводит к появлению в мембранах участков («дыр»), через которые наружу выходит содержимое как самих клеток, так и их органелл.
Первичные продукты ПОЛ разрушаются с образованием вторичных продуктов ПОЛ : альдегидов, кетонов, малонового диальдегида, диеновых коньюгатов. Накоплением в крови малонового диальдегида (МДА) объясняется синдром интоксикации, сопровождающий многие заболевания внутренних органов. Реагируя с SH- и СН 3 -группами белков, МДА подавляет активность цитохром-оксидаз (угнетая тем самым тканевое дыхание) и гидроксилаз. МДА обуславливает также ускоренное развитие атеросклероза.
При взаимодействии МДА с аминогруппами фосфолипидов образуются конечные продукты ПОЛ – Шиффовы основания. Примером этих соединений является пигмент липофусцин, появляющийся на оболочке глаза, на коже с возрастом. Липофусцин представляет собой смесь липидов и белков, связанных между собой поперечными ковалентными связями и денатурированными в результате взаимодействия с химически активными группами продуктов ПОЛ. Этот пигмент фагоцитируется, но не гидролизуется ферментами лизосом, накапливается в клетках, нарушая их функцию.
Негативные последствия активации ПОЛ :
· Повреждение липидного бислоя мембран, в результате чего в клетки проникает вода, ионы натрия, кальция, что приводит к набуханию клеток, органелл и их разрушению.
· Преждевременное старение клеток и организма в целом.
· Взаимодействие высокореактивных продуктов ПОЛ с аминогруппами белков с образованием Шиффовых оснований.
· Изменение текучести (вязкости) мембран, в результате чего нарушается транспортная функция мембран (функционирование ионных каналов).
· Нарушение активности мембраносвязанных ферментов, рецепторов.
Активация ПОЛ характерна для многих заболеваний и патологических состояний:
· атеросклероз и другие сердечнососудистого заболевания;
· поражения ЦНС (болезнь Паркинсона, Альцгеймера);
· воспалительные процессы любого генеза;
· дистрофия мышц (болезнь Дюшенна);
· онкологические заболевания;
· радиационные поражения;
· бронхолегочные патологии.
Федеральное агентство по образованию
ФГОУ ВПО Сибирский федеральный университет
Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Кафедра биохимии и физиологии человека и животных
В.С. Выборова
студентка V курса
(дипломная работа)
Допустить к защите:
Зав. кафедрой, д.м.н., проф. А.А. Савченко
Научный руководитель:
Канд. биол. наук, проф.
Н.М. Титова
Красноярск 2008
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Активные формы кислорода – классификация и свойства
1.2. Перекисное окисление липидов
1.3. Антиоксидантная система
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Объект исследования
2.2. Определение содержания малонового диальдегида
2.3. Определение содержания диеновых коньюгатов
2.4. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение
Список литературы
В последние годы широко обсуждается роль активных форм кислорода (АФК) и инициируемых ими свободнорадикальных процессов при различных патологических процессах, а так же при беременности. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях происходит усиленное образование АФК, под действием которых происходит избыточная и неконтролируемая активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что в конечном итоге может привести к патологическому состоянию, которое сопровождается дисбалансом ферментативных и неферментативных компонентов системы антиоксидантной защиты. Физиологическая беременность может сопровождаться существенными изменениями в про/антиоксидантном статусе.
Характерным проявлением окислительного стресса является интенсификация процессов перекисного окисления липидов, индикатором которой служит увеличение содержания хотя бы одного из его продуктов. Данные о содержании продуктов ПОЛ в биологических объектах могут нести в себе информацию о глубине и степени патологического процесса. В качестве количественных маркеров наиболее часто используются такие интермедиаты ПОЛ, как диеновые конъюгаты (ДК), а также один из его конечных продуктов – малоновый диальдегид (МДА).
Цель данной работы – определение содержания ДК и МДА в плазме крови у женщин в разные периоды беременности.
В задачи работы входило:
1. Определить содержание продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови небеременных женщин.
2. Определить содержание ДК в плазме крови женщин в динамике беременности.
3. Определить содержания МДА в плазме крови женщин в динамике беременности.
Работа выполнена на базе кафедры биохимии и физиологии человека и животных Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского Федерального университета и Хакасского республиканского центра планирования семьи.
Глава 1. Обзор литературы .
Термин активные формы кислорода (АФК) объединяет целый ряд образующихся в организме промежуточных и побочных продуктов восстановления молекул кислорода, таких как супероксидный (О2-), гидроксильный (НО·), пергидроксильный (НО2∙), пероксильный (RO2∙) и алкоксильный (RO∙) радикалы, оксид азота (NO∙), пероксинитрит (ONOO-), гипохлорит (HOCl), перекись водорода (H2O2) и др. Помимо продуктов восстановления О2, к АФК относят также озон (О3) и синглетный кислород 1О2, то есть кислород, находящийся в возбужденном (синглетном) состоянии [Владимиров, 1998; Осипов, Азизова, Владимиров, 2003]. Все АФК, кроме синглетного кислорода, представляют собой разные химические соединения: молекулы (Н2О2), свободные радикалы (ОН, НО2), ион-радикалы (О2-). Поэтому термин активные формы кислорода следует считать собирательным, он подчеркивает высокую реакционную способность промежуточных продуктов восстановления молекулы кислорода, кислородных радикалов и их прекурсоров.
Радикалы кислорода образуются в ходе процессов, связанных с транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию АФК расходуется от 1 до 5% потребляемого кислорода. Однако эта величина может существенно возрастать при изменении кислородного бюджета организма – при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала.
Супероксидный анион-радикал (О2-). Среди кислородных свободных радикалов ему отводят наиболее значительную роль, так как считается, что именно он является родоначальником многих других активных форм кислорода. Супероксидный радикал (СОР) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии . Химическая активность О2- в значительной степени зависит от физико-химического состояния окружающей его клеточной или внеклеточной среды. В водных растворах О2- способен окислять аскорбиновую кислоту, адреналин и тиоловые соединения, выступая как слабый окислитель [Хавинсон, Баринов, Арутюнян 2003]. Значительно более выражены восстановительные свойства супероксидного радикала. В присутствии ионов негемового железа СОР достаточно активно восстанавливает его из трехвалентного в двухвалентное состояние. Это свойство СОР чрезвычайно важно, поскольку двухвалентное железо играет большую роль в образовании агрессивных липидных и гидроксильных радикалов [Владимиров, 1998]. Супероксидный радикал также может восстанавливать содержащие трехвалентное железо комплексы (цитохром с, ферри-ЭДТА) и нитросиний тетразолий .
Образование супероксида в организме в основном происходит при работе митохондриальной и микросомальной цепей переноса электронов, в результате «утечки» электронов с восстановленных элементов этих цепей на молекулярный кислород [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003], при активации фагоцитирующих клеток крови и тканевых макрофагов [Владимиров, 1998], в ходе энзиматических реакций при действии, так называемых «перекись продуцирующих ферментов», моно-и диаминооксидаз, моно-и диоксигеназ, при окислении гемоглобина и миоглобина, а также любых, склонных к аутоокислению биомолекул: аскорбиновой кислоты, восстановленного глутатиона, биогенных аминов [Хавинсон, Баринов, Арутюнян, 2003].
Супероксиданион-радикал – пусковое звено каскада радикальных реакций, приводящих к возникновению большинства АФК и продуктов перекисного окисления липидов. Он участвует в синтезе хемотаксических пептидов, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует действие эндотелиального фактора расслабления, может повреждать мембраны эритроцитов, ингибировать Са-АТФазу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, окислять белки сыворотки, в тоже время его непосредственная цитотоксичность невелика [Воейков, 2004].
Для регуляции уровня О2- в клетках служит высокоспецифичный фермент-антиоксидант – супероксиддисмутаза (СОД), которая обладает существенной способностью ускорять реакции дисмутации радикала с образованием молекул перекиси водорода и кислорода.
О2- + О2- + 2Н+ → Н2О2 + О2
Пероксид водорода. Н2О2 не является свободным радикалом. Образование О2- в любой биологической модельной системе сопровождается накоплением Н2О2, образующимся в результате дисмутации (неферментативно или в присутствии супероксиддисмутазы) [Дубина, 2004]. Поэтому в организме повышение концентрации Н2О2 наблюдается при активации процессов, которые связаны с генерацией супероксидного радикала: при состояниях метаболического взрыва фагоцитирующих клеток; при усиленной деятельности митохондриальных и микросомальных электронтранспортных цепей; при повышении активности оксидазных ферментов.
Будучи стабильным продуктом восстановления кислорода, Н2О2 обладает свойствами слабого окислителя. Эти свойства проявляются, в частности, в присутствии ионов металлов с переменной валентностью в восстановленной форме [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003], в результате чего образуется высокоактивный гидроксильный радикал:
Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + OH
В отсутствии каталазы и ионов металлов переменной валентности пероксид водорода довольно стабилен и вследствие своей незаряженной ковалентной структуры воспринимается клеткой, как молекула воды. Благодаря этому Н2О2 может легко проникать в клетки и ткани, при этом наличие нейтральных аддуктов пероксида водорода (например, гистидина) обеспечивает проникновение внутрь клеток даже в присутствии каталазы. Считается, что биологическая активность Н2О2 существенно зависит от её концентрации. Так, при низких (микромолярных) уровнях Н2О2 является относительно слабореактивной. Однако с ростом концентрации агрессивность пероксида водорода увеличивается и при достаточно высоком (миллимолярном) уровне Н2О2 обладает цитотоксическим действием и может вызывать гибель фибробластов и других типов клеток, включая гепатоциты и эндотелиальные клетки. В сублетальных концентрациях пероксид водорода существенно изменяет статус эндотелиальных клеток, что проявляется в ингибировании транспорта анионов через мембрану, увеличении внутриклеточной концентрации Са2+, активации фосфолипаз и фосфоинозитидного обмена, повреждает Сu,Zn-СОД, тем самым снижая антиоксидантную защиту клеток [Меньщикова с соавт., 2006].
Клетки млекопитающих достаточно устойчивы к воздействию пероксида водорода, благодаря наличию глутатионпероксидазной и каталазной ферментативных систем, первая из которых эффективно работает при малых концентрациях перекиси, вторая – при высоких.
Гидроксильный радикал (НО∙). Одноэлектронное восстановление Н2О2 приводит к образованию гидроксильных радикалов, обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью. Разложение Н2О2 в присутствии ионов двухвалентного железа является основным путем образования НО∙ (реакция Фентона) [Владимиров, Арчаков, 2003]:
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + HO∙
Другой путь образования гидроксильного радикала – это реакция разложения гипохлорита, которая также протекает с участием Fe2+ [Осипов, Якутова, Владимиров 2003; Якутова с соавт., 2004]:
НОCl + Fe2+ → HO + Cl- + Fe3+
Установлено, что образование гидроксильного радикала возможно при разложении гипохлорита также и железонезависимым путем
HOCl +O2- → HO + Cl- + O2-
Вследствие высокой химической активности время жизни ОН-радикалов в клетке составляет около 10-9 с, а расстояние, которое они успевают пройти за это время от места их образования, не превышает 100 нм. Таким образом, клеточная топография повреждающего действия ∙ОН-радикалов и, как следствие этого, характер эффекта повреждения будет зависеть от места их образования. Например, возникновение ОН-радикалов вблизи молекулы ДНК с высокой вероятностью приведет к модификации основания и взрыву одной из цепей ДНК .
Обладая наиболее высоким в живой природе редокс-потенциалом (Е0=+2.7В), и будучи вследствие этого чрезвычайно агрессивным, ∙ОН оказывает действие практически на любую биологическую молекулу. Но наибольший ущерб клетке наносят его реакции с ДНК, белками и полиненасыщенными жирными кислотами внутриклеточных и плазматических мембран, что определяет сильнейшее мутагенное и цитотоксическое действие гидроксильного радикала .
Важно отметить, что в организме нет специальных ферментативных систем, обладающих способностью инактивировать гидроксильный радикал. Низкомолекулярные соединения, такие как урацил, мочевая кислота, салицилаты, глюкоза, диметилсульфоксид, обладают способностью ингибировать ∙ОН-радикал только при достаточно высоких концентрациях [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004]. Таким образом, при целом ряде патологических состояний, сопровождающихся избыточным образованием АФК и, соответственно, гидроксильного радикала, организм становится практически беззащитным перед повреждающим действием этого соединения. Предотвращение повреждений клеточных структур осуществляется только за счет снижения концентрации радикалов предшественников ОН, в частности, супероксиданион-радикала и пероксида водорода.
Синглетный кислород (1О2). Образуется при изменении спина одного из электронов π-орбитали в молекуле кислорода. Источником синглетного кислорода являются реакции фотосенсибилизированного окисления биологических субстратов [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003]. При нефотохимических реакциях образование 1О2 возможно в результате неферментативной дисмутации супероксидных радикалов, протекающей с образованием перекиси водорода в присутствии ионов металлов с переменной валентностью:
О2- + О2- + Н2 → Н2О2 + 1О2
А также при взаимодействии некоторых сильных окислителей, например гипохлорита с Н2О2 и ферментативно – в реакциях восстановления цитохрома с . В отличие от молекулы О2, синглетный кислород обладает высокой химической активностью, особенно по отношению к молекулам, содержащим участки повышенной электронной плотности (ненасыщенные жирные кислоты, ароматические аминокислоты, основания). Типичным для 1О2 являются реакции взаимодействия с двойной связью. Это свойство 1О2 особенно важно для инициирования перекисного окисления ненасыщенных липидов в биологических мембранах [Меньщикова с соавт., 2006]. Кроме того, синглетный кислород, как и гидроксильный радикал, вызывает окисления сульфгидрильных групп в белках, декарбоксилирует аминокислоты, расщепляет нуклеиновые кислоты . Энергичное образование 1О2 в клетке может приводить к её повреждению или даже к гибели [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003].
Одним из наиболее эффективных гасителей синглетного кислорода в клетке является β-каротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 его молекул прежде, чем он подвергнется окислительной деструкции [Владимиров, Арчаков, 2003].
Гипохлорит (НОСl). Хлорноватистая кислота – сильнейший окислитель, образуется в нейтрофилах при участии гем-содержащего цитоплазматического фермента миелопероксидазы . Миелопероксидаза окисляет ионы солей хлористоводородной кислоты, Сl- в присутствии Н2О2 в ходе реакции:
Н2О2 + Сl- + Н+ → НОСl + Н2О
НОСl не является свободным радикалом, но выступает как один из наиболее сильных окислителей.
НОСl атакует простейшие амины, сульфгидрильные группы в белках и хлорированные пуриновые основания в ДНК [Хавинсон c соавт., 2003]. НОСl может взаимодействовать с замещенными арил-аминами (например, с анилином, 1-нафтиламином и 1-нафтолом) даже при физиологических уровнях, образуя долгоживущие продукты, которые связываются с ДНК и являются генотоксичнымим для клеток человека [Осипов, Азизова, Владимиров, 2003].
1.2. Перекисное окисление липидов .
Все активные формы кислорода обладают высокой цитотоксичностью в отношении любых типов клеток и клеточных образований, что определяется их химической активностью. Можно выделить 4 наиболее вероятные мишени окислительной цитотоксической атаки АФК: индукция процессов ПОЛ в биологических мембранах, повреждение мембраносвязанных белков, инактивация ферментов и повреждение ДНК клеток.
Одним из важнейших следствий избыточного образования АФК является избыточная в этих условиях активация процессов ПОЛ [Барабой, 1991]. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, обеспечивающим протекание ряда физиологических процессов. Чрезмерная, патологически усиленная активация процессов ПОЛ под действием АФК приводит к необратимому изменению или повреждению мембранных структур, нарушению их проницаемости для ионов. Процессы ПОЛ можно условно подразделить на 3 последовательных этапа, или фазы развития: процесс зарождения цепей, процессы развития цепных реакций и обрыв цепей [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004].
В биологических мембранах окислению подвергаются преимущественно полиненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав фосфолипидов . На стадии инициирования под действием свободных радикалов О2, ионизирующей радиации, ультрафиолетового облучения и ряда химических веществ, относящихся к прооксидантам, происходит отрыв атома водорода в альфа-положении по отношению к двойной связи. Присутствие двойной связи в жирной кислоте (ЖК) ослабляет связь С-Н в смежных углеродных атомах и тем самым облегчает отщепление Н∙. Чем длиннее ненасыщенная боковая цепь кислоты жирного ряда, тем сильнее у неё склонность подвергнуться липидному окислению [Хавинсон, Баринов, Арутюнян, 2003]. Радикал с углеродом в центре претерпевает молекулярную перегруппировку с образование диена, содержащего сопряженные двойные связи, который в дальнейшем соединяется с О2 и образует радикал пероксида, способный отделить атом водорода от другой ЖК. Возникновение в результате этой реакции органических перекисей и нового радикала способствует продолжению окислительных реакций, приобретающих цепной характер [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004].
Таким образом, перекисное окисление липидов представляет собой процесс, связанный с активацией кислорода, особенность которого заключается в том, что молекула О2 присоединяется к свободному радикалу :
О2 + L∙ → LO2
В результате получается новый пероксильный радикал органического соединения. В дальнейшем происходит взаимодействие этого радикала с новой молекулой органического соединения, в результате чего протекает процесс цепного ПОЛ.
LO2∙ + LH → LOOH + L
L∙ + O2 → LO2∙
Реакции перекисного окисления липидов указаны на рис. 1.
Рис.1. Реакции перекисного окисления липидов [Владимиров, 1998]
Считается, что образование перекисей липидов осуществляется двумя путями: неферментативным – аскорбатзависимым (аскорбиновая кислота регенерирует ионы за счет обратного восстановления Fe3+ до Fe2+), активируемым металлами с переменной валентностью, и ферментативным (НАДФН-зависимым). По первому пути образование перекисей липидов происходит во всех мембранных структурах, а по второму – преимущественно в эндоплазматическом ретикуломе .
Ферментативное ПОЛ относится только к генерации липидных перекисей в активном центре фермента. Образованные при этом гидроперекиси и эндоперекиси являются стереоспецифическими и имеют важные биологические функции. В частности, это относится к циклооксигеназе и липооксигеназе.
Особенность неферментативного цепного окисления в биологических мембранах заключается в том, что оно практически не происходит в отсутствие металлов с переменной валентностью, в частности ионов двухвалентного железа [Владимиров, Арчаков, 2003]. Резко выраженное прооксидантное действие Fe2+ на ненасыщенные жирные кислоты (НЖК) в биологических мембранах обусловлено разложением продуктов реакции гидроперекисей, в результате которого в системе появляются новые свободные радикалы, инициирующие новые цепи окисления:
Fe2+ + LOOH → Fe3+ + OH + LO
При этом радикал LO вступает в дальнейшие реакции цепного окисления:
LO + LH → LOH + L
В последние годы появилось много данных, свидетельствующих, что ионы железа активируют процессы перекисного окисления также за счет того, что они участвуют в образовании гидроксильного радикала [Владимиров, 1998].
В ходе ПОЛ субстрат (полиненасыщенные ЖК) продолжают расходоваться, если только в этот процесс не вмешивается глутатионпероксидаза, восстановленный глутатион, витамин Е или другой антиоксидант , что ведет к прерыванию цепной реакции. Благодаря наличию в организме антирадикальной защиты, процессы пероксидации ограничиваются [Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2004]. Физиологическая роль перекисного окисления заключается в участии в процессах самообновления, самоперестройки биологических мембран, ионного транспорта, регуляции активности мембраносвязанных ферментов и других физиологических реакций . При интенсивном воздействии на организм химических или физических факторов процессы ПОЛ многократно усиливаются, образование АФК возрастает, а когда происходит срыв механизмов антирадикальной защиты, развивается окислительный стресс, который может проявляться на клеточном, тканевом и организменном уровнях. При этом усиление перекисного окисления липидов, чрезмерная продукция органических перекисей приводят к развитию патологических процессов [Суханова, 2004; Барабой с соавт., 2004].
Повышение уровня ПОЛ наблюдается при многих заболеваниях, различных патологических состояниях и интоксикациях. При этом считают, что в случае болезни и интоксикации происходит возрастание ПОЛ, продукты которого и являются ответственными за повреждение клеток и тканей. Однако, как было установлено , поврежденные ткани подвержены перекисному окислению липидов в гораздо большей степени, чем здоровые. Причина этого явления – инактивация некоторых биоантиоксидантов, утечка антиоксидантов из поврежденных клеток и выделение ионов металлов (особенно железа и меди) из мест их накопления в клетках и из металлопротеинов, гидролизованных освободившимися из разрушенных липосом ферментами [Воскресенский, Левицкий, 2003].
Состав продуктов перекисного окисления липидов достаточно сложен. К продуктам цепной реакции ПОЛ, прежде всего, относятся разновидности гидроперекисей, которые способны подвергаться нерадикальным окислительным превращениям, что приводит к образованию первичных (диеновые коьюгаты), и конечных продуктов ПОЛ (малоновый диальдегид, основания шиффа) [Журавлева с соавт., 2003].
Избыточное образование продуктов пероксидации приводит к целому комплексу цитотоксических эффектов, включающих инактивацию ряда ферментных систем, угнетение синтеза белка, повреждение и угнетение синтеза ДНК, лизис клеточных структур, нарушение репродуктивных процессов деления клеток.
Рис.2. Радикальные и нерадикальные продукты ПОЛ
Особенно важно подчеркнуть, что происходит нарушение мембранных структур, изменение транспорта ионов Са2+, создающее угрозу жизни клетки .
Образование АФК, известных как прооксиданты, наблюдается во многих метаболических процессах и является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток, а так же организма в целом, в кислородсодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляют ферментативные и неферментативные антиоксиданты [Петрович, Гуткин, 2005]. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса [Меньщикова с соавт., 2006].
Основными функциями антиоксидантной системы являются: ограничение интенсивности реакции свободнорадикального и перекисного окисления; защита чувствительных к окислительным повреждениям биомолекул мембран, внутри - и внеклеточных структур от действия свободных радикалов и перекисных соединений; восстановление окислительных молекулярных повреждений [Шепелев с соавт., 2004]. В целом основная задача системы антиоксидантной защиты состоит в предотвращении и ограничении развития патологических состояний, вызываемых окислительными повреждениями структур организма [Владимиров, 1998; Журавлев, 2003].
Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время нет. По химической природе биоантиокислители представляют собой широкий класс соединений: ферменты (СОД, каталаза, глутатионпероксидаза (ГПО)), фенолы и полифенолы (токоферолы, эвгенол), флавоноиды (рутин, кверцетин), стероидные гормоны и многие другие соединения [Бурлакова, Храпова, 2004]. В зависимости от растворимости различают жирорастворимые (витамин Е, А, К, убихинон) и водорастворимые (витамин С, SH-содержащие соединения) биоантиокислители, по молекулярной массе выделяют группу низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, α-токоферол, мочевая кислота) и высокомолекулярных (ферритин, каталаза) [Кения, Лукаш, Гуськов, 1993].
К числу энзимных антиоксидантов относят прежде всего супероксидредуктазу (СОР), восстанавливающую О2- в пероксид водорода, СОД, катализирующую реакцию дисмутации О2- с образованием пероксида водорода и молекулярного кислорода , каталазу, восстанавливающую Н2О2, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы (ГТ) .
Рис.3. Антиоксиданты водной фазы [Владимиров, 1998]
Главной ферментативной системой плазмы крови является ГПО внеклеточных жидкостей и ГПО гидроперекисей липидов (ГПО 4), которая будучи липофильным соединением эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфотидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах низкой плотности (ЛПНП), восстанавливая их, следовательно, защищая от окислительной модификации . Кроме того ГПО 4 совместно с токоферолом практически полностью подавляет ПОЛ в биологических мембранах благодаря тому, что витамин Е эффективно восстанавливает пероксирадикалы, а фермент разлагает гидроперекиси, препятствуя тем самым их вовлечению в окислительный цикл .
ГТ, в отличие от селенсодержащей ГПО, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидроперекиси с малым размером молекул, эффективно восстанавливает гидрофобные гидроперекиси с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот (линолевой и арахидоновой), фосфолипидов [Бобырев, Почерняева, Стародубцев, 2005; Колесниченко, Кулинский, 2004].
Вместе с тем во всех водных и липидных фазах организма могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют антиоксиданты-ингибиторы органических радикалов, среди которых важное место занимают соединения фенольного типа. В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений, среди которых выраженным антиоксидантным эффектом обладают витамины Е и К, убихиноны, триптофан и фенилаланин, а так же большинство растительных (флавоноиды) и животных пигментов [Дубина, 2005].
В антирадикальной защите липопротеинов плазмы крови и клеточных мембран α-токоферолу принадлежит ведущая роль – одна его молекула защищает ≈10000 молекул ненасыщенных жирных кислот [Евстигнеева, Волков, Чудинова, 2003], при этом считается, что α-токоферол способен обезвредить не менее 60% образующихся пероксильных радикалов [Тиунов, 1995]. Окисление α-токоферола со свободными радикалами компенсируется биорегенерацией молекул этого антиоксиданта в реакциях восстановления коантиоксидантами (АН), редокс-потенциал которых ниже, чем у радикала α-токоферола (α-Тф-О.) [Бурлакова, Крашков, Храпова, 1998]. В результате такой реакции не только происходит восстановление витамина Е, но и предотвращается возможность инициации α-токофероксильным радикалом окисления липидов:
α-Тф-О. + RH→ α-Тф-ОH + R. (1)
α-Тф-О. + АH→ α-Тф-ОH + А. (2)
В физиологических условиях вторая реакция обычно превалирует над первой, так как константа скорости реакции α-Тф-О. с НЖК не превышает 103М-1с-1, в то время как для реакции (1) константа скорости может достигать значений 104-107М-1с-1.К наиболее изученным коантиоксидантам относятся убихинол, аскорбиновая кислота (АК), билирубин [Менщикова, Зенков, 1993].
Рис.4. Окислительно-восстановителные превращения α-токоферола и сопряженных с ним коантиоксидантов [Меньщикова с соавт., 2006].
АК превосходит другие антиоксиданты плазмы в защите липидов от перекисного окисления, так как только это соединение достаточно реакционноспособно, чтобы эффективно ингибировать инициацию ПОЛ в водной фазе .
Важными внеклеточными антиокислителями являются альбумины – простые гидрофильные белки плазмы крови, которые являются основными носителями SН групп. SН содержащим соединениям принадлежит ведущая роль в защите клеток от ОН-радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате разложения молекул воды под действием ионизирующих излучений.
Необходимо отметить наличие антирадикальных свойств у белков, хелатирующих ионы железа и других металлов с переменой валентностью. В первую очередь это трансферрин, лактоферрин и церулоплазмин. Основная роль трансферрина и близкого ему по структуре лактоферрина, содержащегося в молоке и выделяющегося фагоцитами при их активации, состоит в акцептировании «свободного» железа, что препятствует образованию радикалов НО.в реакциях Фентона, катализируемых ионами Fe [Зборовская, Банникова, 2000].Значимую роль в этом процессе играет церулоплазмин, Cu-содержащий белок, обеспечивающий окисление Fe 2+ до Fe3+ и делающий тем самым железо доступным для связывания трансферрина [Воскресенский с соавт., 2004; Krsek-Staples, Wbster, 2004; Василец, 2004]
Наиважнейшим антиоксидантом внеклеточной жидкости является мочевая кислота (МК). Ввиду высокого ее содержания в плазме крови человека некоторые исследователи считают, что на нее приходится 35-65% защиты липопротеинов от окисления, 10-15% ингибирования НО. и 12% ингибирования синглетного кислорода. Кроме того МК может выступать синергистом с радикалами α-токоферола и аскорбиновой кислотой, что усиливает их антиоксидантное действие [Булгакова, 2006].
Объектом исследования явилась замороженная плазма крови относительно здоровых небеременных и беременных женщин, поставляемая из Хакасского республиканского центра планирования семьи. Плазма хранилась при температуре -20° С до определения концентрации диеновых коньюгатов и малонового диальдегида. Всего было обследовано 127 женщин, деление на группы приведено в таблице 1.
Таблица 1
Группы обследованных женщин
В липидных системах в результате процессов ПОЛ образуется МДА, взаимодействие которого с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) приводит к образованию хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм. [Стальная, 1997].
Реактивы:
1. 30%-ная трихлоруксусная кислота (ТХУ);
2. 0,1 М этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА);
3. 1%-ная тиобарбитуровая кислота;
4. 0,05 н раствор NaOH;
5. Физиологический раствор.
Ход определения:
К 0,2 мл образца добавляли 0,8 мл физиологического раствора и 0,5 мл ТХУ. Перемешивали, оставляли стоять на льду 2 часа. Затем центрифугировали 15 мин. при 3000 об/мин. 1 мл супернатанта переносили в другую пробирку, добавляли 0,075 мл 0,1 М ЭДТА и 1%-ного ТБК, растворенной в 0,05 Н растворе NaOH. Содержимое перемешивали и ставили в кипящую водяную баню на 15 минут. Затем пробирки охлаждали при комнатной температуре и измеряли поглощение при длинах волн 532нм, а затем при 600 нм.
Расчет МДА производят по формуле:
C= _________________ x f,
C – концентрация МДА, мкмоль/л плазмы (эритроцитов),
D600 – оптическая плотность при длине волны 600 нм;
E – коэффициент экстинции 1,56x105М-1см-1;
f – коэффициент разведения. (f=9,94)
Вследствие π-π переходов спектры конъюгированных гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот характеризуются интенсивным поглощением в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 232-234 нм.
Определение содержания ДК проводили в экстрактах эритроцитов. Для этого липиды из эритроцитов экстрагировали стократным избытком смеси растворителей (гептан-изопропанольная смесь в соотношении 1:1). В гомогенизатор вносили 0,1 мл. упакованных эритроцитов, добавляли 5 мл. изопропилового спирта и тщательно растирали до получения гомогенной суспензии. Содержимое гомогенизатора количественно переносили в мерную центрифужную пробирку, в которую затем добавляли 5 мл. гептана.
Экстракт центрифугировали в течение 10 минут при 1700g. Надосадочную фракцию переносили в градуированную пробирку и добавляли 1/5 объема 0,74%-ного водного раствора KCI для отмывки липидного экстракта от нелипидных примесей. После тщательного встряхивания образовавшаяся эмульсия расслаивалась на две прозрачные фазы. В гептановом экстракте (верхняя фаза) измеряли спектрофотометрически содержание сопряженных диенов в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против гептана. Расчет количества ДК производили, используя молярный коэффициент экстинкции при длине волны 233 нм, равный 27000 М¯¹*см¯¹ [Паранич и соавт., 1993] и выражали в ммолях на мл клеток.
Д – оптическая плотность;
К – коэффициент ммолярной экстинкции = 21,0 мМ-1 см-1;
Статистическую обработку результатов осуществляли общепринятыми методами с использованием пакета прикладных программ Statistica 7.0. Достоверность различий оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни, с достоверностью Р<0,05 [Лакин, 1980].
Говоря об общей опасности воздействия свободных радикалов на организм, нельзя обойти эту проблему и у беременных женщин, от здоровья которых зависит будущее целого поколении детей.
При неосложненной беременности в организме женщин происходит целый ряд адапционно-приспособительных процессов, направленных на обеспечение адекватного течения гестационного периода, роста и развития плода. Известно, что важными составляющими адаптивных перестроек являются показатели агрегатного состояния крови, иммунного статуса, эндокринной системы а так же перекисного окисления липидов. В их сбалансированном взаимодействии в ответ на регулирующее влияние гипоталамуса заложено качество адаптации организма [Гусак, 2006].
Физиологическая беременность может сопровождаться существенными изменениями в про/антиоксидантном статусе. Одними из параметров, которые позволяют оценить состояние свободнорадикальных процессов является диеновые коньюгаты и малоновый диальдигид. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях происходит усиленная активация процессов ПОЛ под действием АФК, что приводит к патологическому состоянию.
В данной работе было определено содержание диеновых коньюгатов и малонового диальдегида у небеременных женщин (N=31), которые составили группу контроля. Согласно литературным данным содержание продуктов ПОЛ в частности МДА, являющегося одним из конечных продуктов данного процесса, с возрастом неуклонно возрастает [Банкова, Никанорова, 1988]. В группе небеременных женщин возраст значительно варьировал: от 18 до 39 лет. В связи с этим, мы разделили женщин контрольной группы по возрастному критерию на две подгруппы: в первую подгруппу вошли женщины в возрасте 18-28 лет (N=18), во вторую – 29-39 лет (N=13).
 |
В возрастной подгруппе от 18 до 28 лет содержание ДК составило 0,28 ммоль/л, а в возрастной подгруппе от 29 до 39 лет концентрация увеличилась на 28%. Та же закономерность выявлена и в содержании МДА.
Концентрация МДА в первой подгруппе составила 0,85мкмоль/л, во второй подгруппе уровень МДА повысился на 31%.
Наблюдаемые изменения свидетельствуют о том, что с возрастом на фоне усиления процессов ПОЛ происходит угнетение антиоксидантной системы. Нарушения в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности являются одним из механизмов формирования антиоксидантной недостаточности вследствие чрезмерного усиления ПОЛ.
В результате активации ПОЛ и накопления свободных радикалов происходит окислительная модификация липопротеинов плазмы крови, нарушение структурно-функциональной целостности клеточных мембран, освобождение лизосомальных ферментов, что в конечном итоге приводит к патологическим процессам в клетке и организме в целом.
При анализе содержания ДК и МДА между двумя возрастными подгруппами достоверных отличий не выявлено. Вследствие чего при сравнительном анализе содержания продуктов ПОЛ у беременных и небеременных женщин будут использованы данные по общей контрольной группе. Результаты исследования содержания ДК и МДА в общей контрольной группе приведены на рисунке 7.
Уровень ДК в контрольной группе женщин составил 0,35 ммоль/л, а МДА – 0,96 мкмоль/л. Наши данные по содержанию МДА в плазме крови согласуются с приведенными в литературе [Гусак, 2006]. Данных по содержанию ДК в плазме крови у относительно здоровых женщин мы в доступной литературе не встретили.
Анализ полученных результатов показал, что уровень ДК, являющихся первичными продуктами ПОЛ, существенно превышает таковой для конечного продукта – МДА.
Согласно данным литературы, у женщин показатели перекисного окисления липидов, а так же антиоксидантной системы изменяются в динамике репродуктивного цикла (1, 7, 14, 21 дни) [Гусак, 2006]. В первые дни менструального цикла происходит увеличение соотношения адреналин/серотонин, что свидетельствует о преобладании в функциональной активности гипоталамуса адренергических компонентов. Это приводит к депрессии противосвертывающей и антиокислительной систем крови, а так же активации клеточного и гуморального иммунитета, повышению неспецифической иммунной резистентности. Что проявляется увеличением концентрации диеновых коньюгатов и малонового диальдегида, активацией свертывающего потенциала крови.
К 21 дню цикла активность АОС прогрессивно увеличивается, на фоне этого снижается количество продуктов ПОЛ, в том числе ДК и МДА. Это необходимо для обеспечения процессов имплантации в слизистую матки, развития плаценты и создания оптимальных условий, которые позволят, с одной стороны – обеспечить надежную защиту организма женщины, а с другой – вынашивание беременности. Данная закономерность имеет глубокий биологический смысл и направлена на обеспечение условий для реализации репродуктивной функции человека.
В данной работе мы не учитывали возможность влияния динамики репродуктивного цикла женщин на уровень продуктов ПОЛ, хотя это явление могло отразиться на полученных результатах.
Во время гестации, начиная с момента зачатия и до завершения родов, в организме матери возникают интегративные процессы, которые необходимы для поддержания функционального единства организма матери и плода. Эти процессы позволяют выполнить главную задачу, то есть сохранение плода, и заключается в адаптации в I триместре беременности.
Несмотря на то, что в антигенном отношении мать и плод всегда несовместимы, в большинстве случаев после имплантации бластоцисты беременность развивается нормально и завершается родами в срок. Если бы взаимоотношения между матерью и плодом строились по варианту реципиент – аллотрансплантат, то беременность вряд ли продолжалась дольше срока, чем выживание обычного трансплантата. Следовательно, в системе "мать – плод" существуют механизмы, направленные на сопереживание двух антагонистически настроенных субъектов.
В данной работе было определено содержание ДК и МДА в плазме крови у беременных женщин (N=96), разделенных по триместрам, в возрасте от 20 до 28 лет.
Группу сравнения составили небеременные женщины. Результаты определения уровня ДК и МДА приведены на рисунках 8 и 9.
 |
У женщин в I триместре беременности наблюдается достоверное повышение уровня продуктов ПОЛ по сравнению с контролем. Так, содержание ДК и МДА повысилось на 74 и 77% соответственно. Это можно объяснить тем, что сразу же после зачатия происходит значительная перестройка жизнедеятельности организма беременных женщин, которая сопряжена с изменениями в системах крови, гемостаза, эндокринной, иммунной системах и с изменением биохимического состояния организма в целом. «Не ожидая» подобных изменений, ткани и органы испытывают определенный стресс, в результате которого резко повышается количество свободных радикалов, атакующих, помимо прочего, клетки плаценты и эмбриона.
Увеличение количества свободных радикалов (СР) во время беременности связано с различными причинами. Одной из причин является их участие в синтезе прогестерона. СР активируют процесс перекисного окисления липидов, в результате которого образуются гидроперекиси холестерина, являющиеся предшественниками данного гормона.
Прогестерон является очень важным гормоном, необходимым для поддержания всего течения беременности. Он подготавливает эндометрий матки к имплантации оплодотворенной яйцеклетки, а затем способствует сохранению беременности: подавляет активность гладкой мускулатуры матки, поддерживает в центральной нервной системе доминанту беременности; стимулирует развитие концевых секреторных отделов молочных желез и рост матки, синтез стероидных гормонов; оказывает иммунодепрессивное действие, подавляя реакцию отторжения плодного яйца [Савченко с соавт., 2006].
Рис 9. Концентрация прогестерона при разных сроках беременности
Кроме того, прогестерон является предшественником стероидных гормонов плода, а так же эстрогенов, андрогенов, альдостерона и других гормонов коры надпочечников. Содержание прогестерона в крови беременной женщины увеличивается, повышаясь в 2 раза к 7-8 неделе, а затем более плавно возрастает к 34 недели (Рис 9). Следовательно, интенсификация процессов перекисного окисления липидов во время беременности является физиологически необходимым процессом.
Гормональные связи «пронизывают» все компоненты функциональной системы мать-плацента-плод. Так, в I триместре беременности происходит тесное взаимодействие материнско-плацентарной эндокринной системы, а во II и особенно в III триместрах плод и плацента выступают как общий орган синтеза эстрогенов.
Дальнейший анализ полученных нами данных показал, что уровень как МДА, так и ДК во II триместре беременности продолжает достоверно расти как по сравнению с группой контроля, так и c I триместром беременности.
Концентрация ДК во II триместре беременности увеличилась по сравнению с группой небеременных женщин и I триместром на 151 и 69% соответственно. Содержание МДА возросло на 97 и 11% так же по сравнению с контролем и I триместром беременности.
Сравнение уровней содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ во II триместре беременности по сравнению с I триместром показал более выраженный прирост концентрации диеновых коньюгатов по сравнению с малоновым диальдегидом. Этому явлению можно найти несколько объяснений.
Во-первых, из литературных данных известно, что МДА может метаболизироваться. В этом процессе принимает участие альдегиддегидрогеназа. Наличие такого фермента отмечено в плазме крови [Соловьева, 2007].
Во-вторых, МДА является чрезвычайно реакционноспособным соединением, способным вступать в образование шиффовых оснований с соединениями, содержащими NH2-группы. К такому роду соединений относятся аминокислоты, низкомолекулярные пептиды и прочие соединения. В этом случае часть МДА извлекается из пула свободного МДА, образуя так называемый «связанный» МДА, концентрация которого, как показали некоторые исследования, повышается при ряде патологических состояниях. Используемая нами методика позволяет определить только свободный МДА без учета связанного МДА.
В-третьих, нельзя исключить, что метаболизм продуктов липопероксидации во II триместре такой, что скорость превращения ДК в МДА снижена.
В III триместре содержание ДК в плазме крови беременных женщин достигает своего максимума и составляет 1,07 ммоль/л. Уровень МДА так же повышается по сравнению с контролем и вторым триместром на 160 и 31% соответственно.
Согласно литературным данным повышение продуктов ПОЛ в III триместре беременных обусловлено угнетением ферментативных и неферментативных механизмов антиперекисной защиты. Происходит снижение активности каталазы [Гусак, 2007] и церулоплазмина (ЦП) [Качалина, Морозова, 2003]. ЦП обладает ферроксидазной активностью, а так же ингибирует супероксидный анион-радикал, избыток которого приводит к усилению процесса ПОЛ.
Кроме того, в плазме крови церулоплазмин совместно с трансферрином образует антиоксидантную систему, регулирующую концентрацию восстановленных ионов железа, и суммарная антиокислительная активность плазмы крови в отношении Fe2+ -индуцированного ПОЛ в основном определяется содержанием в ней данных компонентов [Меньщикова, 2006].
Так же в III триместре беременности происходит возбуждение адренергических структур гипоталамуса, что приводит к увеличению соотношения адреналин/серотонин, депрессии антиоксидантного потенциала плазмы крови и активации иммуногенеза [Гусак, 2007].
Усиление процессов перекисного окисления липидов в крови беременных женщин может быть связано с различными причинами.
Чрезмерное и бесконтрольное увлечение препаратами железа может стать причиной увеличения числа свободных радикалов, так как любой антиоксидант в определенных условиях может выступать прооксидантом, инициируя окислительные процессы [Меньщикова с соавт., 2006]. В то же время дефицит железа может способствовать развитию железодефицитной анемии (ЖДА), следствием которой является тканевая гипоксия [Мусаев, 2004].
По данным литературы длительная гипоксия приводит к истощению АОС, что влечет за собой неконтролируемый процесс липопероксидации и накопление продуктов свободно-радикального окисления, оказывающих неблагоприятное влияние на систему мать-плацента-плод [Евсюкова, Савельева, 2005].
Другой причиной является образование активных форм кислорода при применении лекарственных средств. Подвергаясь всевозможным ферментативным превращениям в организме, молекулы некоторых лекарств теряют свои электроны в этих химических реакциях, превращаясь в свободные радикалы.
Состояние стресса так же оказывает мощное влияние на активацию процессов ПОЛ. Гормоны стресса, адреналин и кортизол, при неблагоприятных жизненных ситуациях вырабатываются в повышенных количествах, нарушая питание и нормальное дыхание клетки, что моментально приводит к накоплению и распространению радикалов во всем организме.
Так же важно отметить, что беременные женщины подвергаются регулярному влиянию неблагоприятных факторов окружающей среды: загрязненный воздух, табачный дым, ультрафиолетовое излучение. Это усугубляет процесс физиологического течения беременности при условии дефицита антиокислителей. Кроме того данные литературы свидетельствуют о корреляции окислительного напряжения организма матери и неблагоприятным результатом беременности, в том числе выкидыше.
3. Уровень ДК в плазме крови в I и II триместрах беременности достоверно повышается на 74 и 151% соответственно по сравнению с группой контроля. В III триместре концентрация диеновых коньюгатов достигает своего максимума и составляет 1,07 ммоль/л.
Банкова В.В. Деградация малонового диальдегида в эритроцитах и ее возрастные, сезонные и суточные изменения / В.В. Банкова, Т. М. Никанорова // Вопр. мед. Химии, 1988. - № 6. - С. 27-29.
Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов / В.А. Барабой // Успехи соврем. Биологии, 1991. - Т. 111. - № 6. - С. 923-931.
Барабой В.А. Перекисное окисление и стресс / В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Голожин с соавт. - М.: Наука, 2004. - 148 с.
Бобырев В.Н. Специфичность систем антиоксидантной защиты органов и тканей – основа дифференцированной фармакотерапии антиоксидантами / В.Н. Бобырев, В.Ф. Почерняева, С.Г. Стародубцев // Экспериментальная и клиническая фармакология, 2005. – Т. 57. - №1. - С. 78-86.
Бондарь Т.Н. Восстановление органических гидроперекисей глутатионпероксидазой и глутатион-S-трансферазой: влияние структуры субстрата / Т.Н. Бондарь, В.З. Ланкин, В.А. Антоновский // Докл. АН СССР, 1989. - T. 304. - №1. – С. 217-220.
Булгакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Булгакова Е.Б. // Успехи химии, 2006. - № 9. – 250 c.
Бурлакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран / Е.Б. Бурлакова, Н.Г. Храпова // Успехи химии, 2004. - Т. 54. - C. 1540-1558.
Бурлакова Е.Б. Роль токоферолов в пероксидном окислении липидов биомембран / Е.Б. Бурлакова, С.А. Крашков, Н.Г. Храпова // Биологические мембраны, 1998. - Т. 15, № 2. - С. 137-167.
Василец И.М. Церулоплазимины. Их молекулярная структура и биологические функции / И.М. Василец // Успехи биол. Химии, 2004. - № 14. - С. 172-200.
Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биомембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 2003. – С. 230-272.
Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И. Деев с соавт. // Итоги науки и техники, 2000. – Т. 29. - С. 151-167.
Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестн. РАМН, 1998. - № 7. - С. 43-51.
Воейков В.Л. Благотворная роль активных форм кислорода / В.Л. Воейков // Биохимия, 2004. - № 1 - С. 27-38.
Воскресенский О.Н. Перекиси липидов в живом организме / О.Н. Воскресенский, А.П. Левицкий // Вопр. мед. Химии, 2003. - Т. 16. - № 6. – С. 563-583.
Воскресенский С.К. Антиоксидантная система, онтогенез и старение / С.К. Воскресенский, И.А. Жутаев, В.Н. Бобырев с соавт. // Вопр. мед. Химии, 2004. - № 1. - C. 14-27.
Гусак Ю.К. Психонейроиммунологические особенности адаптивных механизмов нормального репродуктивного цикла у женщин [Электронный ресурс] / Ю.К. Гусак, Ю.В. Лазарева, В.Н. Морозов, 2006. – Режим доступа: http:www.mednet.сom
Гусак Ю.К. Психонейроиммунологические особенности адаптивных механизмов при нормально протекающей беременности [Электронный ресурс] / Ю.К. Гусак, Ю.В. Лазарева, В.Н. Морозов, 2007. - Режим доступа: http:www.mednet.сom
Дубина Е.Е. Некоторые особенности функционирования ферментной антиоксидантной защиты плазмы крови человека / Е.Е. Дубина // Биохимия, 2005. - Вып. 2. – С. 3-18.
Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутазы в тканях организма / Е.Е. Дубинина // Успехи современной биологии, 2004. - Т. 108. - №1. – C. 3-17.
Евстигнеева Р.П. Витамин Е как универсальный антиоксидант и стабилизатор биологических мембран / Р.П. Евстигнеева, И.М. Волков, В.В. Чудинова // Биол. Мембраны, 2003. - № 2. С. 119-137.
Евсюкова И.И. Свободнорадикальное окисление у доношенных новорожденных детей с различной патологией / И.И. Евсюкова, Т.В. Савельева // Педиатрия, 2005. - №1. – С. 13-16.
Журавлев А.И. Биоантиокислители в живом организме / А.И. Журавлев. - М.: Наука, 2003. - C. 19-30.
Журавлева Т.Д. Возрастные особенности свободнорадикального окисления липидов и антиоксидантной защиты в эритрацитах здоровых людей / Т.Д. Журавлева, С.Н. Суплотов, Н.С. Киянюк с соавт. // Вопр. мед химии, 2003. - № 5. - C. 17-18.
Зборовская В.А. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме / В.А. Зборовская, М.В. Банникова // Вестник РАМН, 2000. - № 6. - С. 53-63.
Зенков Н.К. Окислительный стресс / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньщикова. - М.: Наука, 2004. - 343с.
Качалина Т.С. Прогностическая значимость определения церулоплазмина в третьем триместре беременности [Электронный ресурс] / Т.С. Качалина, Т.А. Морозова, 2006. – Режим доступа: http: www.iprit.ru/ chemical agents action=1179
Кения М.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе / М.П. Кения, А.И. Лукаш, Е.П. Гуськов // Успехи современной биологии, 1993. - Т. 113. - № 4. - С. 456-468.
Колесниченко Л.С. Глутатионтрансферазы / Л.С. Колесниченко, В.И. Кулинский // Успехи совр. Биологии, 2004. - Т. 107. - вып. 2. - С. 179-193.
Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высш. школа, 1998. - 293с.
Меньщикова Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем. Биологии, 1993. - Т. 113. - №4. - C. 442-453.
Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. / Е.Б. Меньщикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков с соавт. - М.: «Слово», 2006. – 553 с.
Мусаев А.Т. Диагностика гипоксии плода по данным показателей перекисного окисления липидов и антиокислительной активности / А.Т. Мусаев // Педиатрия, 2004. - № 12. – С. 88-96.
Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи соврем. биологии, 2003. - Т. 31. - C. 180-208.
Осипов А.Н. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа / А.Н. Осипов, Э.Ш. Якутова, Ю.А. Владимиров // Биофизика, 2003. – Т. 38. - вып 3. – С. 390-396.
Петрович Ю.А. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса / Ю.А. Петрович, Д.В. Гуткин // Патол. физиол. и экперим. Терапия, 2005. - № 5. - С. 85-92.
Савченко А.А. Система мать-плацента-плод. Вопросы функциональной диагностики / А.А. Савченко, Н.М. Титова, Л.А. Новикова с соавт. - Красноярск: РИО КрасГУ, 2006. – 129 с
Соловьева А.Г. Активность альдегиддегидрогеназы в эритроцитах, тромбоцитах и плазме крови крыс в норме и при ожоге / А.Г. Соловьева // Успехи соврем. Естествознания, 2007. - № 12. – С. 12-15.
Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии под ред. Ореховича В.Н., 1997. - С. 63-64.
Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии под ред. Ореховича В.Н., 1997. - C. 66-68.
Суханова Т.А Патохимия клетки / Т.А. Суханова // Успехи соврем. биологии, 2004. – Т. 40. – С. 82-104.
Тиунов Л.А. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты / Л.А. Тиунов // Вестн. РАМН, 1995. - № 3. - C. 9-13.
Хавинсон В.Х. Свободнорадикальное окисление и старение / В.Х. Хавинсон, В.А. Баринов, А.В. Арутюнян с соавт. - СПб.: Наука, 2003. - С. 10-122.
Шепелев А.П. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев, И.В. Корниенко, А.В. Шестопалов с соавт. // Вопр. мед. Химии, 2004. - № 2. - С. 15-17.
Якутова Э.Ш. Образование свободных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа / Э.Ш. Якутова, Е.С. Дремина, С.А. Евгина с соавт. // Биофизика, 2004. – Т. 39. - вып. 2. – С. 275-279.
Abiaka C. Effect of Prolonged Storage on the Activities of Superoxide Dismutase, Glutathione Reductase, and Glutathione Peroxidase / C. Abiaka, F. Al-Awadi, S. Olusi // Clinical Chemistry, 2003. - Vol. 46. - Issue 4 - P. 560-576.
Auchere F. What is the ultimate fate of superoxide anion in vivo? / F. Auchere, F. Rusnak // J. Biol. Inord. Chem., 2005. - Vol. 7 - P. 664-667.
Beyer R. E. The participation of coenzim Q in free radical production and antioxidation / R. E Beyer // Free Radic. Biol. Med., 2004. – Vol. 8. – P. 545-565.
Birringer M. Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: structure-function relation / M. Birringer, J. H. EyTina, B A. Salvatore // Br. J. Cancer., 2003. – Vol. 88. – P. 1948-1955.
Carole B. Rudra A prospective study of early-pregnancy plasma malondialdehyde concentration and risk of preeclampsia / Carole B. Rudra, Chunfang Qiu, Robert M. David at аl. // Clinical Biochemistry, 2006. – Vol. 39. – P. 722-726.
Chen R. Microdialysis sampling combined with electron spin resonance for superoxide radical detection in microliter samples / R. Chen, J. T. Warden, J. A. Stonken // Anal. Chem., 2004. - Vol. 76. - P. 4734-4740.
Cord J.M. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) / J. M. Cord, I. Fridovich // J. Biol. Chem., 2000. - Vol. 244. - Issue 22. - P. 6049-6055.
Dix T.A. Mechanisms and biological significance of lipid peroxidation initiation / T.A. Dix, J. Aikens // Chem. Res. Toxicol., 2005. - Vol. 6. - Р. 2-18.
Eisenberg W. C. Cytogenetic effects of singlet oxygen / W. C. Eisenberg, K. Taylor, R. R. Guerrero // J Photochem. Photobiol., 2002. – Vol. 16. – P. 381-384.
Galeotti T. Oxy-radical metabolism and control of tumour growth / T. Galeotti, L. Masotti, S. Borello // Xenobiotika, 2003. – Vol. 21. – P. 1041-1052.
Gutteridge J. M. C. Lipid peroxidation and antioxidation as biomarkers of tissues damage / J. M. C. Gutteridge // Clinikal Chemistry, 2005. - Vol. 41. - №12. - P. 1819-1828.
Halliwell B. Oxygen toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease / B. Halliwell, J. M. C Gutteridge // Biochem., 2004. – Vol .215. - P. 1-14.
Kira, Y. Association of Cu-Zn-type superoxide dismutase with mitochondria and peroxisomes / Y.Kira, E. F. Sato, M. Inoue // Arsh. Biochem. Biophys., 2003. – Vol. 399. – P. 96-102.
Klebanoff, S. J.Myeloperoxidase: role in neutrophil – mediated toxicity / S. J. Klebanoff // Molecular Biologi and Infectious Diseases., 2006. – Vol. 24. - P. 283-289.
Krsek-Staples, J.A. Ceruloplasmin inhibits carbonyl formation in endogenous cell proteins / J. A. Krsek-Staples, R. O. Wbster // Free Radic Biol. Med., 2004. - Vol. 14. - Р. 115-25.
Maiorino, M. Prooxidant role of vitamin E in copper induced lipid peroxidation / M. Maiorino, A. Zamburlini, A. Roveri // FEBS Lett., 2005. – Vol. 330. – P. 174-176.
Melov, S. Animal models of oxidative stress, aging and therapeutic antioxidant interventions / S. Melov // Int. J. Biochem. Cell Biol., 2003. – Vol. 34. – P. 1395-1400.
Meral, A. Lipid peroxidation and antioxidant status in beta-thalassemia / A. Meral, P. Tuncel, E. Surmen-Gur // Pediatr. Hematol. Oncol., 2000. - Vol. 17. - P. 687-693.
Michiels, C. Cytotoxicity of linoleic acid peroxide, malondialdehyde and 4-hydroxynonenal towards human fibroblast / C. Michiels, J. Remacle // Toxicology, 2004. - Vol. 66. - №2. - P. 225-234.
Okado-Matsumoto, A. Subcellular distribution of superoxide dismutases in rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria / A. Okado-Matsumoto, I. Fridovich // J. Biol. Chem., 2003. - Vol. 276. - P. 38388-38393.
Padayatty, S. J. Vitamin C as an Antioxidant: Evaluation of Its Role in Disease Prevention / S. J. Padayatty, A. Katz, Y. Wang // Journal of the American College of Nutrition, 2003. - Vol. 22. - Р. 18-35.
Thomas, J. P. Enzymatic reduction of phospholipid and cholesterol hydroperoxides in artificial bilayers and lipoproteins / J. P. Thomas, P. G. Geiger, M. Maiorino et al. // Biochim. Biophys. Acta., 2006. – Vol. 1045. – P. 252-260.
Tohoku, J. Nitric Oxide, Lipid Peroxides, and Uric Acid Levels in Pre-Eclampsia and Eclampsia / J Tohoku // Biochem., 2004. – Vol. 15. - P. 87-92.
Ursini, F. The role of selenium peroxidases in the protection against oxidative damage of membranes / F. Ursini, A. Bindoli // Chem. Phys. Lipids., 2005. – Vol. 44. – P. 255-276.
Wendel, T. Enzimes acting against reactive oxygen / A Wendel // Enzymes, 2004. – Vol. 34. – P. 161-167.
Young-Ju Kim Oxidative stress in pregnant women and birth weight reduction / Young-Ju Kim, Yun-Chul Hong, Kwan-Hee Lee // Reproductive Toxicologi, 2005. – Vol. 19. – P. 487-492.
The present work is devoted to the mechanisms of lipid peroxidation and antioxidant defence. A special attention is paid to the experimental research of the products of lipid peroxidation.
The purpose of this work is measuring of the level of MDA and DС in blood plasma of women in different stages of pregnancy.
The maintenance of a recreation center DС and MDA in plasma of blood of not pregnant women has made 0,26 - 0,54 mmol/l and 0,64-1,28 µmol/l accordingly.
The level of a recreation center in plasma of blood in I and II trimesters of pregnancy authentically raises on 74 and 151 % accordingly in comparison with group of the control. In III trimester concentration DС reaches the maximum and makes 1,07 mmol/l.
Maintenance MDA in plasma of blood in I, II, III trimesters of pregnancy progressively increases for 77, 97, 160 % accordingly in comparison with group of not pregnant women.
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Перекисное окисление липидов
Введение
Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются свободнорадикальными и постоянно происходят в организме. Свободнорадикальное окисление нарушает структуру многих молекул. В белках окисляются некоторые аминокислоты. В результате разрушается структура белков, между ними образуются ковалентные "сшивки", всё это активирует протеолитические ферменты в клетке, гидролизующие повреждённые белки. Активные формы кислорода легко нарушают и структуру ДНК. Неспецифическое связывание Fe 2+ молекулой ДНК облегчает образование гидроксильных радикалов, которые разрушают структуру азотистых оснований. Но наиболее подвержены действию активных форм кислорода жирные кислоты, содержащие двойные связи, расположенные через СН 2 -группу. Именно от этой СН 2 -группы свободный радикал (инициатор окисления) легко отнимает электрон, превращая липид, содержащий эту кислоту, в свободный радикал.
ПОЛ - цепные реакции, обеспечивающие расширенное воспроизводство свободных радикалов, частиц, имеющих неспаренный электрон, которые инициируют дальнейшее распространение перекисного окисления.
Стадии перекисного окисления липидов
1) Инициация: образование свободного радикала (L*)
Инициирует реакцию чаще всего гидроксильный радикал, отнимающий водород от СН 2 -групп полиеновой кислоты, что приводит к образованию липидного радикала.
2) Развитие цепи
L * + О 2 > LOO *
LOO* + LH > LOOM + LR*
Развитие цепи происходит при присоединении О 2 , в результате чего образуется липопероксирадикал LOO* или пероксид липида LOOH.
ПОЛ представляет собой свободнорадикальные цепные реакции, т.е. каждый образовавшийся радикал инициирует образование нескольких других.
3) Разрушение структуры липидов
Конечные продукты перекисного окисления полиеновых кислот - малоновый диальдегид и гидропероксид кислоты.
4) Обрыв цепи - взаимодействие радикалов между собой:
LOO* + L* > LOOH + LH
L* + vit E > LH + vit E*
vit E* + L* > LH + vit Е окисл.
Развитие цепи может останавливаться при взаимодействии свободных радикалов между собой или при взаимодействии с различными антиоксидантами, например, витамином Е, который отдаёт электроны, превращаясь при этом в стабильную окисленную форму.
Повреждение клеток в результате перекрестное окислении липидов
Активные формы кислорода повреждают структуру ДНК, белков и различные мембранные структуры клеток. В результате появления в гидрофобном слое мембран гидрофильных зон за счёт образования гидропероксидов жирных кислот в клетки могут проникать вода, ионы натрия, кальция, что приводит к набуханию клеток, органелл и их разрушению. Активация перекисного окисления характерна для многих заболеваний: дистрофии мышц (болезнь Дюшенна), болезни Паркинсона, при которых ПОЛ разрушает нервные клетки в стволовой части мозга, при атеросклерозе, развитии опухолей. Перекисное окисление активируется также в тканях, подвергшихся сначала ишемии, а затем реоксигенации, что происходит, например, при спазме коронарных артерий и последующем их расширении.
Такая же ситуация возникает при образовании тромба в сосуде, питающем миокард. Формирование тромба приводит к окклюзии просвета сосуда и развитию ишемии в соответствующем участке миокарда (гипоксия ткани). Если принять быстрые лечебные меры по разрушению тромба, то в ткани восстанавливается снабжение кислородом (реоксигенация). Показано, что в момент реоксигенации резко возрастает образование активных форм кислорода, которые могут повреждать клетку. Таким образом, даже несмотря на быстрое восстановление кровообращения, в соответствующем участке миокарда происходит повреждение клеток за счёт активации перекисного окисления. перекисное окисление липид антиоксидантный
Изменение структуры тканей в результате ПОЛ можно наблюдать на коже: с возрастом увеличивается количество пигментных пятен на коже, особенно на дорсальной поверхности ладоней. Этот пигмент называют липофусцин, представляющий собой смесь липидов и белков, связанных между собой поперечными ковалентными связями и денатурированными в результате взаимодействия с химически активными группами продуктов ПОЛ. Этот пигмент фагоцитируется, но не гидролизуется ферментами лизосом, и поэтому накапливается в клетках, нарушая их функции.
ПОЛ происходит не только в живых организмах, но и в продуктах питания, особенно при неправильном приготовлении и хранении пищи. Прогоркание жиров, образование более тёмного слоя на поверхности сливочного масла, появление специфического запаха у молочных продуктов - всё это признаки ПОЛ. В продукты питания, содержащие ненасыщенные липиды, обычно добавляют антиоксиданты - вещества, ингибирующие ПОЛ и сохраняющие структуру компонентов пищи.
Системы защиты клеток от активных форм кислорода
Ферменты антиоксидантного действия . К ферментам, защищающим клетки от действия активных форм кислорода, относят супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу. Наиболее активны эти ферменты в печени, надпочечниках и почках, где содержание митохондрий, цитохрома Р 4 50 и пероксисом особенно велико. Супероксиддисмутаза (СОД) превращает супероксидные анионы в пероксид водорода:
2 + 2H + > H 2 O 2 + O 2 .
Изоферменты СОД находятся и в цитозоле и в митохондриях и являются как бы первой линией защиты, потому что супероксидный анион образуется обычно первым из активных форм кислорода при утечке электронов из дыхательной цепи.
СОД - индуцируемый фермент, т.е. синтез его увеличивается, если в клетках активируется перекисное окисление.
Пероксид водорода, который может инициировать образование самой активной формы ОН*, разрушается ферментом каталазой:
2Н 2 О 2 > 2 Н 2 О + О 2 .
Каталаза находится в основном в пероксисомах, где образуется наибольшее количество пероксида водорода, а также в лейкоцитах, где она защищает клетки от последствий "респираторного взрыва".
Глутатионпероксидаза - важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как он разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (г-глутамилцистеинилглицин). Сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу.
Н 2 О 2 + 2 GSH > 2 Н 2 О + G-S-S-G.
Окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой:
GS-SG + NADPH + Н + > 2 GSH + NADP + .
Глутатионпероксидаза, которая восстанавливает гидропероксиды липидов в составе мембран, в качестве кофермента использует селен (необходимый микроэлемент пищи). При его недостатке активность антиоксидантной защиты снижается.
Витамины, обладающие антиоксидантным действием
Витамин Е (б-токоферол) - наиболее распространённый антиоксидант в природе - является липофильной молекулой, способной инактивировать свободные радикалы непосредственно в гидрофобном слое мембран и таким образом предотвращать развитие цепи перекисного окисления. Различают 8 типов токоферолов, но б-токоферол наиболее активен.
Витамин Е отдаёт атом водорода свободному радикалу пероксида липида (ROO*), восстанавливая его до гидропероксида (ROOH) и таким образом останавливает развитие ПОЛ (рис. 1).
Свободный радикал витамина Е, образовавшийся в результате реакции, стабилен и не способен участвовать в развитии цепи. Наоборот, радикал витамина Е непосредственно взаимодействует с радикалами липидных перекисей, восстанавливая их, а сам превращается в стабильную окисленную форму - токоферолхинон.
Витамин С (аскорбиновая кислота) также является антиоксидантом и участвует с помощью двух различных механизмов в ингибировании ПОЛ. Во-первых, витамин С восстанавливает окисленную форму витамина Е и таким образом поддерживает необходимую концентрацию этого антиоксиданта непосредственно в мембранах клеток. Во-вторых, витамин С, будучи водорастворимым витамином и сильным восстановителем, взаимодействует с водорастворимыми активными формами кислорода - , Н 2 О 2 , ОН* и инактивирует их.
в-Каротин, предшественник витамина А, также обладает антиоксидантаьш действием и ингибирует ПОЛ.
Витамин Е (а-токоферол) ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона, что приводит к инактивации радикала липида, а витамин Е превращается в стабильный, полностью окисленный токоферолхинон.
Рис. 1. Механизм антиоксидантного действия витамина Е
Диета, обогащённая витаминами Е, С, кароти-ноидами, существенно уменьшает риск развития атеросклероза и заболеваний ССС, подавляет развитие катаракты - помутнения хрусталика глаза, обладает антиканцерогенным действием. Имеется много доказательств в пользу того, что положительное действие этих компонентов пищи связано с ингибированием ПОЛ и других молекул и, следовательно, с поддержанием нормальной структуры компонентов клеток.
Размещено на Allbest.ru
...Анализ перекисного окисления в плазме крови и гомогенате почек у контрольной группы животных и у тех, кто подвергся воздействию тетрахлорметана. Уровень антиоксидантных ферментов в плазме и почках после введения витамина Е до и после его воздействия.
дипломная работа , добавлен 11.05.2014
Активные формы, функции и механизмы возникновения кислорода. Типы окислительных реакций. Антиоксидантная система организма, факторы клеточной защиты. Антиоксидантные ферменты крови. Виды свободных радикалов. Процессы перекисного окисления липидов.
курсовая работа , добавлен 29.09.2015
Окисление органических соединений и органический синтез. Превращение, протекающее с увеличением степени окисления атома. Соединения переходных металлов. Реакции окисления алкенов с сохранением углеродного скелета. Окисление циклических соединений.
лекция , добавлен 01.06.2012
Кинетический анализ схемы перекисного окисления нефтяных сульфидов. Влияние способа приготовления катализатора на кинетику перекисного окисления нефтяных сульфидов. Автокатализ в реакции окисления нефтяных сульфидов в присутствии оксида молибдена.
курсовая работа , добавлен 13.01.2015
Понятие об оксидазном типе окисления. Оксигеназный тип окисления. Роль микросомального окисления. Специфические превращения аминокислот в организме. Обезвреживание чужеродных веществ. Связывание в активном центре цитохрома. Восстановление железа в геме.
презентация , добавлен 10.03.2015
Роль окисление органических соединений в промышленном органическом и нефтехимическом синтезе. Классификация процессов окисления по разным признакам. Синтез винилацетата, димеризация меркаптанов, эпоксидирование олефинов, демеркаптанизации природного газа.
реферат , добавлен 28.01.2009
Высшие жирные кислоты. Биосинтез карбоновых кислот. Сложные эфиры высших одноатомных спиртов и высших жирных кислот. Простые липиды триацилглицерины. Реакции окисления липидов с участием двойных связей. Окисление с расщеплением углеводородного скелета.
реферат , добавлен 19.08.2013
Использование 3,3",5,5"-тетраметилбензидина в аналитической химии. Методика эксперимента и необходимые исходные вещества, посуда, оборудование. Расчет скорости реакций окисления ТМБ методом тангенсов на начальном участке кривых после периода индукции.
курсовая работа , добавлен 04.12.2011
Сущность и виды окисления - химических реакций присоединения кислорода или отнятия водорода. Ознакомление с методами восстановления металлов в водных и соляных растворах. Изучение основных положений теории окислительно-восстановительных реакций.
реферат , добавлен 03.10.2011
Понятие степени окисления элементов в неорганической химии. Получение пленок SiO2 методом термического окисления. Анализ влияния технологических параметров на процесс окисления кремния. Факторы, влияющие на скорость получения и качество пленок SiO2.
